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RT-PCR法测定胎鼠大脑皮质内皮素-1 mRNA 安徽医科大学学报 2000年第5期第35卷 技术与方法 作者：袁中玉　王明丽　李京培　陈贵海 单位：袁中玉　王明丽　李京培（安徽医科大学袁中玉　王明丽1微生物教研室，合肥　230032）；陈贵海（第一附属医院神经内科，合肥　230022） 关键词：内皮缩血管肽-1；分析；大脑皮质；聚合酶链反应；小鼠；近交Balb/c 　　摘要　目的　建立一种检测先天性人巨细胞病毒感染胎鼠大脑皮质内皮素-1（ET-1）mRNA的方法。方法　采用逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）方法并对实验条件进行优化。建立稳定的检测体系后，对胎鼠大脑皮质ET-1 mRNA进行检测，并以RT-PCR后产物的OD值来反映起初ET-1 mRNA的模板相对含量。结果　在一定Taq DNA酶、镁离子浓度、引物浓度等条件下，ET-1 mRNA经RT-PCR扩增后产物的OD值与ET-1 mRNA模板量成正比。结论　优化条件后的RT-PCR是检测ET-1 mRNA的一种敏感、简便、特异、可靠的方法。 　　中图分类号　R349.21　　　　文献标识码　A 　　文章编号　1000-1492(2000)05-0384-03 　　内皮素-1（Endlthelin-1, ET-1）是1988年由日本学者从猪主动脉上皮细胞中分离提取的一种生物活性肽，是目前所知作用最强的血管收缩剂〔1〕。随后的研究表明〔2〕，在中枢神经系统（CNS）普遍有ET-1存在，而且3/4 ET-1分布在神经细胞内。ET-1作为局部神经肽及神经调节剂对中枢神经系统功能的影响，尤其它在脑损伤后具有刺激胶质细胞增生和迁移、促进受损神经元复性等方面的重要作用而备受关注〔3〕。为进一步研究ET-1作用机制，有必要建立一种敏感、简便的ET-1 mRNA测定方法。据此，我们采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法对先天性感染HCMV胎鼠大脑皮质进行了检测。现将结果报道如下。 　　1　材料与方法 　　1.1　实验动物　取健康纯系Balb/c小鼠，♀16只，♂16只，均约10周龄，体重约30 g。通过腹腔内注射HCMV AD169株病毒悬液，建立类似人类先天性HCMV感染的动物模型。待雌鼠孕龄为19天时，剖腹取出胎鼠双侧大脑皮质进行RT-PCR。 　　1.2　主要化学和分子生物学试剂　所用的主要化学及分子生物学试剂分别购自Sigma公司、Promega公司和华美生物工程公司（SABC）。ET-1及人血β-珠蛋白引物设计参见文献〔1，4〕，由中科院上海植物生理所植物分子遗传国家重点实验室合成。 　　1.3　总RNA的分离　按SABC提供的RT-PCR RNA一步样品处理试剂盒进行。具体过程：将100 mg组织放在研磨器(DEPC处理过)中研成匀浆, 加200 μl变性液和50 μl氯仿∶异戊醇(24∶1),充分混匀后,离心(4℃,14 000 r·min-1)5 min, 将上清转移至另一个新的离心管中, 加入等体积异丙醇,颠倒混匀，离心(4℃,14 000 r·min-1) 10 min, 小心倒去液体，将沉淀用75%乙醇洗一次, 离心(4℃,14 000 r·min-1) 5 min, 弃去上清,自然干燥沉淀，得到的RNA沉淀用TE（pH 8.0）20 μl重悬。该方法提取的产物经国产UV-754紫外分光光度计反复测定3次，其OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间。 　　1.4　逆转录　根据SABC提供的RT-PCR酶混合物试剂盒配制以下反应混合物: RT-PCR酶混合物2 μl，20×buffer（无Mg2+）1.5 μl，上、下游引物各0.3 mmol·L-1，25 mmol·L-1 MgCl2 2 μl，10 mmol·L-1 dNTPs 2 μl，模板 10 μl，加DEPC处理的无菌双蒸水至终体积30 μl，铺上液体石蜡30 μl，稍混匀离心后，37℃反转录60 min，得到的cDNA直接进行下一步PCR扩增。 　　1.5　PCR　基本方法参考文献〔4〕。我们在对影响PCR结果较大的Mg2+浓度、引物浓度和Taq酶浓度等因素进行优化后，以人血β-珠蛋白DNA为靶基因进行了参比对照实验。在建立稳定的检测体系后，准备以下主混合物：反转录产物15 μl，10×buffer（含15 mmol·L-1 Mg2+） 5.0 μl，上、下游引物各0.3 mmol·L-1，人血β-珠蛋白上、下游引物各0.3 mmol·L-1,人血β-珠蛋白DNA模板 10 μl，Taq DNA聚合酶2 U，加DEPC处理的无菌双蒸水至终体积50 μl，最后加入液体石蜡50 μl，稍混匀稍离心后，置PCR仪中，94℃预变性5 min，然后循环35个周期(94℃ 45 s，55℃ 4