低温乙醇法在人血白蛋白工业化生产中应用.docVIP

低温乙醇法在人血白蛋白工业化生产中的应用 　　摘 要：人血浆中含有数量众多的蛋白成分，如何把它们分离开来一直是个比较热门的课题。二战时期，哈佛大学的Cohn教授发明了低温乙醇分离法后，血浆蛋白分离工业才得以蓬勃发展起来。本文将结合低温乙醇法的基本原理以及笔者实际的工作经验和体会，对人血白蛋白的工业化生产过程进行阐述。 　　关键词：低温乙醇法 人血白蛋白 工业化生产 　　 　　人血浆中已经发现的蛋白成份约有100多种，其中已经分离提纯和性质明了的有60余种，大约20种已经有临床用途。血浆蛋白的分离，是利用不同蛋白成份的理化性质，如分子大小、密度高低、表面结构、荷电状态等的区别，将其互相分开。 　　血浆蛋白分离工业在中国起步比较晚，直到上世纪80年代才真正开始了大规模的工业化生产，目前全国有30余家血制品生产企业，但其中大部分企业的主要产品仅有人血白蛋白和静脉注射用人免疫球蛋白这2种血浆中含量最大的成份，可以说对血浆资源的利用率是比较低的。 　　血浆蛋白分离的方法很多，其中大部分方法只适用于实验室研究使用，如电泳、等点聚焦等，可以应用于大规模生产的只有沉淀法（盐析、有机溶剂法等）、层析法（凝胶层析、离子交换层析以及亲和层析），另外的超滤、吸附、变性处理等均为辅助手段。目前，国内用于生产人血白蛋白和免疫球蛋白类制品的生产方法基本都是低温乙醇法。笔者结合低温乙醇法的基本原理以及本人实际的工作经验和体会，对人血白蛋白的工业化生产过程进行阐述。 　　人血白蛋白是一个一级结构简单的单链蛋白，无碳水化合物侧链，仅含少量的脂肪酸，构型较为对称，分子量约为69000D，由585个氨基酸残基组成，富含门冬氨酸及谷氨酸，而缺乏色氨酸。天然状态下，白蛋白含有19个负电荷，其i.e.p依溶液中含有的盐的种类与浓度的不同在pH4.4~5.4之间。 　　低温乙醇法的原理和要点为：往蛋白质的水溶液中加入乙醇，产生几种效应，主要效应是降低水分子的活度，降低溶液的介电常数，从蛋白分子周围排代水分子，使蛋白分子和蛋白分子之间通过极性基团的相互作用在范德华引力下发生凝聚，从而沉淀下来。影响这种沉淀过程的主要有5大参数：溶液的蛋白浓度、pH值、离子强度、溶液的温度和乙醇的浓度。在前4个参数都一致的情况下，乙醇的沉淀作用取决于蛋白分子的大小。在逐渐提高乙醇浓度时，蛋白将按分子大小顺序先后沉淀。人血白蛋白作为血浆主要成分中分子量最小的一种，是在最后一步的沉淀反应中分离出来的。下面是人血白蛋白生产的简要工艺流程图。（其中的部分主要参数进行了模糊化处理） 　　人血白蛋白制备工艺流程 　　 　　步骤①：原料血浆的检测。在现今血液传播疾病越来越令人恐惧的情况下，对血浆进行常见的5种病毒检测是国家的强制标准，而且必须是对每一袋单采血浆进行5项病毒检测，合格后方可投入生产。 　　步骤②：8%乙醇沉淀反应，产生组份I沉淀，主要成分为纤维蛋白原。组份I沉淀可以用于人纤维蛋白粘合剂的生产。在此步骤之前一般会对原料血浆进行一次离心，可以分离得到冷沉淀，这也是制造凝血因子VIII的原料。离心去除冷沉淀之后的血浆可以用于人凝血酶原复合物（凝血因子II、VII、IX、X的混合物）的吸附生产。然后可以进行8%乙醇沉淀反应（若不生产凝血因子VIII和人凝血酶原复合物，也可以直接对原料血浆进行8%乙醇沉淀反应）。由于工业化生产中投入的血浆数量巨大（一般一次为5000千克血浆左右），反应罐的容积也是很大的，如我们公司使用的是5吨容量的罐。巨大的体积给乙醇浓度和pH值的调节带来了一些问题。显然我们不可能像在实验室中那样一边加入缓冲液一边搅拌，同时用pH计直接测试。实际采取的方法是：准确抽取10ml的溶液，滴定至指定的pH值，然后将所用的缓冲液量扩大到一个罐的反应液所需的量。一般情况下，需要加入的缓冲液量都会有数十千克，50%的乙醇大概会有500千克以上，往反应罐中加入这些液体的时候一定要控制好速度，加得太快会使局部pH值或酒精浓度超出限度而导致不良后果，加得太慢则会拖长生产周期。沉淀反应完成以后，需要将反应液静置数小时，以利于沉淀的积聚（一般还会按一定的比例往反应液中加入硅藻土作为助滤剂），而后就可以进行分离，以收集沉淀，同时将上清液转移入另外的反应罐以备进行下一步的沉淀反应。现今最常用的分离器具是压滤机（以前也经常使用高速离心机来分离沉淀，但其使用成本和工人的劳动强度均比压滤机要高，因此逐渐被压滤法取代），它其实就是一台大型的板框滤器，配合相应规格的滤板，反应液在压缩空气或泵的驱动下穿过滤器，沉淀被滤板截留在板框中，待液体过完后一并取出。每台压滤机大概可以容纳400千克以上的沉淀。 　　步骤③：20%乙醇沉淀反应，分离出组份II+III沉淀，其主要成份为各种类型的球蛋白和凝血因子