急性药物性内耳损伤中cav1.3钙通道及三种细胞凋亡因子的检测及变化-detection and changes of cav 1.3 calcium channel and three cytokines in acute drug-induced inner ear injury.docx

1、绪言氨基糖甙类药物是应用极其广泛的一类抗生素，其对格兰阴性菌的抑制作用强大，抗菌谱广，价格低廉，使用方便，对维护人类的健康起到的重要的作用。但是氨基糖甙类抗生素同时也是造成人耳毒性（包括听力损害和前庭功能障碍）的第一致病因素。[1]通过动物模型进行氨基糖甙类抗生素的耳毒性作用机制的研究，有助于人们深入认识其致病的详细机理，也有利于发现阻止内耳损害的药物和方法，从而减低应用氨基糖甙类抗生素的潜在风险。目前关于氨基糖甙类抗生素的耳毒性作用机制有许多假说，包括线粒体损害学说，氧自由基形成学说，钙超载学说，等等。这些学说都在许多实验中得到了一定的证实，但尚没有一种学说能完全解释耳毒性发生的全部过程。很可能氨基糖甙类抗生素的耳毒性是通过多条途径共同作用引起的。钙离子是耳蜗内一类重要的物质，其不仅维持细胞内外的电位差，发挥着重要的电生理功能，更在细胞的生物信号转导、氧自由基的活化、凋亡程序的启动中起着重要的作用。钙离子的平衡对机体的生命活动至关重要，钙离子的超载将导致细胞信号传递、电解质平衡和能量代谢的紊乱。[2、3]钙离子的内流主要是通过电压依赖性钙离子门控通道，顺离子浓度梯度进入细胞内。其中CaV1.3(α1D)钙离子通道主要分布在血管纹、毛细胞、螺旋韧带等处。[4]这些部位也是耳蜗内代谢活跃、耗氧耗能高的部位，线粒体分布密度高，活性大。钙离子通道功能的障碍必将导致细胞钙平衡的紊乱，从而造成胞质内钙离子浓度失衡。有研究发现，耳蜗毛细胞内钙离子浓度的增加引起细胞钙超载可能是细胞死亡的最终途径。当细胞膜和钙离子通道都受到损害时，细胞外钙离子可以不受控制地通过通透性提高的胞膜自胞外流入胞质内。而另一方面，细胞线粒体是细胞的能量库和凋亡因子储存库，一旦因为各种原因导致线粒体功能的紊乱，必然引起能量代谢的停滞和线粒体的崩溃。大量钙离子和细胞凋亡因子释放入细胞质中，激活细胞自毁程序，最终导致细胞的凋亡。氨基糖甙类抗生素对细菌的杀伤作用来自于其能与细菌内70S核糖体的特异性结合。而线粒体DNA与细菌的质粒存在许多相似之处。线粒体DNA独立复制、转录和翻译，同时接受胞核DNA的调控。线粒体的70S核糖体由30S和50S的两个亚基组成，与细菌的十分类似，30S亚基能与氨基糖甙类药物特异性结合。这可能是氨基糖甙类抗生素损害线粒体功能的重要途径。本实验以4周龄的C57BL/6J小鼠为研究对象，通过给予卡那霉素和速尿快速诱导小鼠的耳蜗损伤，检测其听力损害，并对毛细胞、血管纹、螺旋神经节等进行形态学观察；运用分子生物学方法检测了CaV1.3钙通道蛋白基因mRNA表达的改变；用免疫组织化学方法检测了细胞色素C、caspase-3以及p53这三种细胞凋亡因子的分布和在病理状态下的改变。从而进一步揭示了氨基糖甙类抗生素导致的内耳损害的机制。2、实验材料2.1研究对象C57BL/6J小鼠，购自南京大学模式动物研究所，在华中科技大学同济医学院附属同济医院实验动物中心按照清洁级标准饲养和繁殖，饲养环境保持清洁、通风，低噪音。选取4周龄健康的小鼠共20只，不限定雌雄，检查小鼠应毛发光滑，眼睛明亮，身体匀称，动作敏捷，对声音的刺激有敏锐的反应，如听到击掌声后身体瞬间颤动、呆立原地保持不动数秒等。将小鼠随机分成两组，其中，甲组设定为实验组，乙组设定为对照组。2.2主要实验试剂硫酸卡那霉素（粉剂），美国Sigma公司。使用时用生理盐水配成50mg/ml的溶液，按照1mg/g剂量体重进行颈部皮下注射。速尿（呋塞米注射液），芜湖康奇制药有限公司。安瓿规格2ml/20mg，使用时按照0.4mg/g剂量体重进行腹腔注射。三溴乙醇：美国fluka公司，在4摄氏度下保存，使用时用生理盐水配成10mg/ml的溶液，按照300mg/kg剂量体重进行麻醉。Na2EDTA(乙二胺四乙酸钠)：武汉博士德公司。粉剂，使用时用双蒸水配置为10%溶液，以氢氧化钠调节pH到7.2-7.4并加入15%体积的甲醛。4%多聚甲醛：武汉博士德公司。蔗糖，武汉博士德公司。Tissue-TekOCTCompoud（冰冻切片用组织包埋剂）：美国SAKURA公司。多聚赖氨酸：武汉博士德公司。用于载玻片的包被，提高切片的贴片附着率，防止切片从玻片上脱落。苏木素：武汉博士德公司。用于普通免疫组织化学中的胞核染色。DEPC，美国MERCK公司。1L的蒸馏水中加1mlDEPC原液，用以浸泡容器和配置无RNase溶液。如用于浸泡器械，可不再高压消毒；如配置不含RNase的溶液则应高压消毒，消毒后DEPC分解为无毒的水和二氧化碳。Trizol，美国Invitrogen公司。RNA逆转录试剂盒，日本TOYOBO公司。FITC标记的羊抗兔IgG，杭州Multisciences公司。Marker1，广州东盛生物公司。过氧化物酶阻断剂（3%