家蝇musca domestica抗真菌肽maf-1基因的克隆 表达及其时空表达模式研究-cloning and expression of musca domestica musca dometica antifungal peptide maf - 1 gene and its spatio-temporal expression pattern.docxVIP

英文缩略词表77论文独创性声明 78附：综 述79家蝇（Musca domestica）抗真菌肽 MAF-1 基因的克隆、表达及其时空表达模式研究专业：病理学与病理生理学 博士生：付萍导师：吴建伟 教授摘要目的：1、克隆家蝇抗真菌肽 MAF-1（Musca domestica antifungal peptide-1）的 cDNA 序列，推导 MAF-1 的全长氨基酸序列，并进行生物信息学分析。2、 构建 MAF-1 的 E.coli 表达体系并检测表达产物的抗真菌活性。3、初步揭示 MAF-1 基因在家蝇内的时空表达模式。方法：1、根据已知 MAF-1 的 N 端氨基酸序列设 计简并引物，提取家蝇 3 龄幼虫的总 RNA，采用 RACE 技术分别克隆 MAF-1 的 3’ 端和 5’端 cDNA 序列，进而拼接得到 MAF-1 的全长 cDNA 序列并对其进行生物信 息学分析。2、根据所得 MAF-1 的 cDNA 序列设计引物，克隆 MAF-1 成熟肽部分的 基因片段，用原核表达载体 pET-28a(+)，构建原核重组表达质粒，并转化至大 肠杆菌 BL21/DE 感受态细胞中，将转化菌菌液用亲和层析柱纯化获得带 His 标签 序列的重组 MAF-1 融合蛋白；用重组 MAF-1 融合蛋白制备大鼠多克隆抗体，进行 Western Blotting 鉴定；以白假丝酵母菌（ATCC10231）为指示菌检测表达产物 的抗真菌活性。3、以 GAPDH 基因为内参基因，采用实时荧光定量 PCR（Real Time PCR）技术检测实验室驯化家蝇、野生家蝇生活史各发育阶段中 MAF-1 基因的表 达差异，家蝇 3 龄幼虫脂肪体、唾液腺、肠道和体壁中 MAF-1 的表达差异，以及 热诱导前后不同时间的家蝇 3 龄幼虫中 MAF-1 基因表达水平的变化。结果：1、 MAF-1 的编码 cDNA 序列全长 537bp，翻译后为 178 个氨基酸残基组成的蛋白多肽。 生物信息学分析结果显示，所得 MAF-1 蛋白序列具有一段信号肽，成熟肽部分的 理论分子量为 17184.2Da，等电点为 5.37，与其实际检测的分子量 17208.384Da，等电点 4.96 相近。同时，MAF-1 是以α螺旋为主的线性蛋白，其序列中可能的一功能结构域位于第 128 至 153 位氨基酸残基处。另外，MAF-1 序列中有 2 个蛋 白激酶 C 磷酸化位点 (Protein kinase C phosphorylation site)、1 个 N 端酰 基化位点(N-myristoylation site)，多个蛋白相互作用位点。模建的 MAF-1 的 三维空间结构图为以α螺旋为主要二级结构的线性蛋白。2、成功构建 MAF-1 原 核重组表达质粒，并转化至大肠杆菌 BL21/DE 中，纯化得到带 His 标签序列的重 组 MAF-1 融合蛋白；Western Blotting 鉴定显示所得 MAF-1 融合蛋白具有免疫 原性，可被用其制备的大鼠多克隆抗体识别；抗真菌活性检测结果显示，获得的 重组 MAF-1 融合蛋白对白假丝酵母菌（ATCC10231）具有明显的抗真菌活性。3、 MAF-1 基因在家蝇内的时空表达模式研究结果显示，在实验室驯化家蝇及野生家 蝇的卵、1 龄幼虫、2 龄幼虫、3 龄幼虫、蛹和雌雄蝇各生长阶段中，MAF-1 基因 均有不同程度的表达。其中，驯化家蝇中 MAF-1 基因在 1 龄幼虫和 2 龄幼虫内的 表达最高，其次是 3 龄幼虫。蛹、雄蝇内的表达与卵期相近，雌蝇内 MAF-1 的表 达较卵期有所下调。野生家蝇中 MAF-1 的表达在 1 龄、2 龄、3 龄幼虫内均比卵 期增强，其次是在蛹、雌蝇内的表达，而在雄蝇和卵内的表达相对最低。家蝇 3 龄幼虫经热诱导后，MAF-1 基因在其体内的表达均有所上调。在热诱导后 12h， 家蝇 3 龄幼虫内的 MAF-1 基因表达水平最高，在热诱导后 48 小时，表达水平趋 近于诱导前的表达水平，但 MAF-1 基因的表达与诱导后时间的长短并未显现出线 性关系。在家蝇 3 龄幼虫的各主要组织中，唾液腺和脂肪体中的 MAF-1 基因表达 水平明显比体壁及肠道高。结论：1、家蝇独特的抗真菌肽 MAF-1 的 cDNA 全长序 列为 537bp，翻译后为 178 个氨基酸残基组成的蛋白多肽，是一全新的以α螺旋 结构为主的线性昆虫抗真菌肽， GenBank 的登录号为 HM178948。 2、成功构建 了能够表 达 具 有 体 外 抗 真 菌 活 性 的 重 组 MAF-1 融 合 蛋 白 的 大 肠 杆 菌 pET-28a(+)-MAF-1-BL21 表达体系，证明了克隆的 MAF-1cDNA 序列及其生物信