第二讲 蛋白质表达、纯化和结晶-2.ppt

柔性蛋白 Special protein 切除柔性区域 Fusion partner Fusion partner B-Adrenergic Receptor 15.9 埃 Fusion partner Fusion partner Fusion partner Still functional Fusion partner Two fortune Fusion partner Fusion partner Fusion partner Fusion partner 2012 5 NCS Maybe Nobel Prize * 由盐的结晶说起 * * * Automation High Throughput New factors 压力 Sazaki 等用双光束干涉仪测定了高压下的溶菌酶蛋白四方结晶及正交结晶的溶解度变化。实验表明，随着压力的增高其正交结晶的溶解度降低，而四方结晶的溶解度增大。可能是由于不同晶型的蛋白质分子的疏水亲水程度不同，随着压力的变化，与水的作用效果不同并反映出溶解度的变化的不同。因此，已有越来越多的研究者开始利用压力作为蛋白质结晶过程中的一个重要的调整参数以得到目的产物。 New factors 外加物理场 蛋白质分子带有不同的离子和极性基团，当施加外加电场时有可能会引起带电分子在结晶体系中的分布的变化，从而导致结晶行为的变化。Taleb 等以溶菌酶蛋白为实验对象，研究了外加电场对其结晶的影响，结果表明：在外加电场的作用下，溶菌酶蛋白的结晶成核速率较无外加电场时有所降低，但所得蛋白质晶体变大。也有人对应用外加磁场影响蛋白质分子的结晶进行了研究，发现磁场不仅能够影响结晶速率，而且可以通过抑制或加速某一生长方向的速率来改变最终获得晶体的晶型 New factors 伴结晶 New factors Fab New factors 对称性 Symmetry Symmetry New factors Symmetry Symmetry If add some compound Symmetry Symmetry Symmetry Symmetry Special protein 糖基化蛋白 Special protein 糖基酶预处理 膜蛋白 Special protein 温和去垢剂处理 膜蛋白 膜蛋白的最适结晶环境是什么 脂立方 脂立方 脂立方 Hexagonal crystal Rhombic crystal Monoolein cubic phase Monopalmitolein cubic phase 脂立方 Hexagonal crystal Rhombic crystal 脂立方 脂立方 脂立方 1 Difficult to manipulate 2 Is it really? Nanodisc Nanodisc Science 2012 Inactive Cys Cys Cys Cys Active Venus Flytrap Module Cystein-rich domain 7TM domain Kunishima Nature 2000 Nanodisc One is enough? Nanodisc Nanodisc 蛋白质结晶条件 杂质、晶核及其他因素如温度、溶液PH值 及振动等都会影响结晶过程。 为使蛋白质结晶，要求： 蛋白质纯度足够高，不含其他化合物。 蛋白质分子表面性质相同，聚集形式均一。 蛋白质溶解在合适的溶剂中。 溶液达到过饱和，使蛋白质形成小的聚集体，作为晶体生长的晶核。晶核形成，晶体才开始生长。 溶液的过饱和度要降至最低水平，避免太多的晶核产生。 晶体生长尽量缓慢以便在结构中达到最大的有序度，方法：改变温度，蛋白质浓度等。 蛋白质的结晶 Protein Sample Protein Concentration: 5-20mg/ml Salt concentration: as low as possible. If the protein is not soluble, change the pH of the buffer or add small amounts of different salts. Buffer concentration: 5-10mM, 10-20 times lower than the buffer concentration used in the well. (100mM in the first screen). Stabilizer:DTT, EDTA and protease inhibitors. A typical protein buffer is 10mM TEA/HCl,