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DNA连接酶 催化机理: DNA连接酶能催化双链DNA切口处的5’-磷酸根和3’-羟基生成磷酸二酯键。 这种反应需要供给能量，大肠杆菌和其他细菌的DNA连接酶以NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)作为能量来源，动物细胞和噬菌体的连接酶则以ATP作为能量来源。 DNA连接酶的作用机制分三步进行： 1) ATP+DNA ligase(E)→ E-AMP+PPi。 2) E-AMP上的AMP转移到DNA的5′磷酸根上，使其活化，释放出酶。 3) 活化的5′磷酸根与相邻的3′羟基形成3′，5′-磷酸二酯键，并释放出AMP。 * * pGEM?-T Vector DNA 重组 主要有两种： T4噬菌体DNA连接酶。 大肠杆菌DNA连接酶。 DNA连接酶 连接方式： 相同粘性末端的连接 平头末端的连接 粘末端连接法 若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。同源粘性末端包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。相同内切酶产生的粘末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。而不同酶产生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。以上两类粘性末端的连接方法都很重要。 平端连接法： 待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由酶切后产生的平端和补平后产生的平端。一般由酶切产生的平端较易连接。但在试验过程中，往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末端，这时，就需要将末端进行“补平”或去除3?突出端，然后再用T4噬菌体DNA连接酶连接两个平端。不过，平端连接的效率是比较低的，一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的用量可提高平端的连接效率，有时也可采取在平端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，也可以提高连接的效率 。 另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正确插入的频率。通过一些处理可以减少自连现象的发生。常用的方法是用细菌的或小牛肠的碱性磷酸酶(BAP or CIP)去掉载体5?-磷酸来达到抑制DNA片段的自身环化的目的。 综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体的一端为EcoR I ，另一端为BamH I，它们都能产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互补，所以能够得到较好的重组结果。 连接反应的一项重要参数是温度。理论上讲连接反应的最佳温度是37℃，此时连接酶的活性最高。但37℃时粘性末端分子形成的配对结构极不稳定，因此人们找到了一个既可最大限度地发挥连接酶的活性，又有助于短暂配对结构稳定的最适温度即4~16℃。 DNA的连接主要有粘性末端和平端连接法，这些主要根据外源片段的末端性质、质粒性质以及两者的酶切位点来确定。 连接温度 5’- GAATTC-3’ 3’- CTTAAG -5’ 5’- GTTAAC-3’ 3’- CAATTG -5’ EcoRⅠ的识别序列 HaeⅠ的识别序列 5’NNNNNNNGAATTCNNNNNNNN3’ 3’NNNNNNNCTTAAGNNNNNNNN5’ 5’NNNNNG 3’NNNNNCTTAAp EcoRⅠ的识别序列和酶切切口（粘端） pAATTCNNNNNN3 GNNNNNN5’ 5’NNNNNNGTTAACNNNNN3‘ 3’NNNNNNCAATTGNNNNN5‘ 5’NNNNNGTT pAACNNNNN3’ 3‘NNNNNCAAp TTGNNNNN5’ HaeⅠ的识别序列和酶切切口（平端） 磷酸二酯键的形成 DNA连接酶 DNA连接酶 DNA连接酶 目的基因与载体的连接 接 粘端连接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCGG GGCC HapⅡ T4-DNA连接酶 *