gx50对与皮肤衰老相关的nfκb通路的调节作用-regulatory effect of gx50 on nf κ b pathway related to skin aging.docxVIP

GX50 对与皮肤衰老相关的 NF-κB 通路的调节作用摘要研究背景 目前已有研究证明，尼古丁(即烟碱)可以通过激活α7 烟碱型乙酰胆碱受 体（α7nicotin acetylcholine receptor，α7nAChR）来抑制核因子κB（nuclear transcription fator-kappa B，NF-κB）信号通路，从而预防老年痴呆症[1]。但尼古丁会使人上瘾， 重复使用尼古丁会加快心脏速度和升高血压并降低食欲。大剂量的尼古丁会引起恶 心呕吐，严重时会致死。由于α7nAChR 是尼古丁的主要效应部位，魏冬青教授针对 尼古丁发挥作用的α7nAChR，采用生物信息学方法设计并筛选得到一种化合物 GX50。GX50 是花椒中的一种天然组分，使用安全。我们实验室前期研究发现，GX50 对巨噬细胞、神经细胞和内皮细胞中的 NF-κB 信号通路都具有调节作用，为了探究 它对皮肤衰老的作用，我们以皮肤为模型，研究 GX50 对皮肤衰老及 NF-κB 信号通 路的作用，为该化合物应用于临床做准备。有文献表明哺乳动物老化普遍与 NF-κB 有关，证明年老皮肤中 NF-κB 被严重阻断能逆转许多老化特征[2]。已证实人类和小 鼠的许多组织中转录因子 NF-κB 可能是与老化有关的转录变化的活化剂。年龄性衰 老小鼠皮肤的 NF-κB 基因被阻断，能使整体基因表达程序逆转到年轻时的状态，在 形态学上表型也会恢复到年轻时候的状态[3]。目的 探究 GX50 对皮肤衰老及 NF-κB 信号通路的作用，为该化合物应用于临床做 准备。方法 为了探究 GX50 在皮肤衰老中的作用，我们主要从组织水平和细胞水平两方面进行研究。在组织水平上，进行了涂药实验，给老年小鼠背部皮肤左侧涂抹溶于 二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO）和甘油中的 GX50，右侧只涂 DMSO 和甘油做对照，两周后剪取两侧皮肤制作冰冻切片。首先进行 HE 染色，比较实验组和对照组皮肤的差别。为进一步说明两侧皮肤的区别，我们选择胶原蛋白抗体进行 免疫组化染色，比较实验组和对照组胶原蛋白表达量。为了探究 GX50 促使皮肤年轻化的作用靶点是否也是 NF-κB 信号通路，对实验组 和 对 照 组 皮 肤 进 行 了 电 泳 迁 移 率 分 析 （ Electrophoretic Mobility Shift Assay ， EMSA）实验，通过测定 NF-κB 入核量，来检验 NF-κB 的活性。使用 Western Blot 的方法对皮肤组织浆蛋白进行检测，检验标准是 NF-κB 信号通路中 NF-κB 的抑制因子 I-κB 磷酸化的程度。 在 细 胞 水 平 上 ， 进 行 小 鼠 表 皮 细 胞 的 原 代 培 养 并 选 取 广 谱 角 蛋 白 （ PanCytokeratin，PCK）一抗进行免疫荧光染色鉴定其纯度。对细胞进行 GX50、脂多糖（lipopolysacharide，LPS）和空白对照（Blank）处理，然后提取表皮细胞膜蛋白、 核蛋白和浆蛋白，并在紫外分光光度计下对所提蛋白进行浓度测定。药物设计方法已经发现 GX50 能有效地激活α7nAChR，应用 Octet RED 生物相互作用分析仪，检测 GX50 与表皮细胞膜α7nAChR 的结合能力。通过 EMSA 来检测表皮细胞 NF-κB的活性。通过 Western Blot 来检测 IκB 磷酸化的程度。II结果 （1）小鼠皮肤组织切片 HE 染色结果显示：表皮部分，左侧比右侧平坦，基底层细胞大小、形态较规整，胞外基质排列较紧密；真皮部分，左侧比右侧毛囊多 而密，黑素细胞数目较多，黑色素沉积较少；表皮与真皮的交界处，左侧皮肤交界比较明显，表皮与真皮的连接比较牢固。（2）小鼠皮肤组织切片免疫组化结果发现左侧比右侧的胶原蛋白表达明显增加（P＜0.05）。（3）小鼠皮肤组织 EMSA 结果显 示涂有 GX50 的皮肤组织中入核的 NF-κB 蛋白量比对照组有所降低（P＜0.05），从而证实 GX50 对 NF-κB 的活化有一定的抑制作用。(4) 小鼠皮肤组织 Western Blot结果显示在实验组比对照组上样量多的情况下，对照组有隐约的 p-IκB 的条带，而 涂有 GX50 的实验组没有看到条带。通过内参校正，认为 GX50 可能抑制了 I-κB 的磷酸化，从而阻遏了 NF-κB 的活化，使其对下游靶基因的调节减弱。（5）受体结合曲线趋势说明 GX50 对皮肤调节作用的靶点可能就是α7nAChR。（6）EMSA 滞后带 灰度分析说明表皮细胞 GX50 组 NF-κB 的入核量低于空白对照组（P＜0.05），说明GX50 降低了 NF-κB 的活性。（7）结果