(食品微生物课件）第二部分 微生物技术知识.ppt

2 ．电子显微镜的制样 生物样品在进行电镜观察前必须进行固定和干燥，否则镜筒中的高真空会导致其严重脱水，失去样品原有的空间构型。此外，由于构成生物样品的主要元素对电子的散射与吸收的能力均较弱，在制样时一般都需要采用重金属盐染色或喷镀，以提高其在电镜下的反差，形成明暗清晰的电子图像。 ( l ）透射电镜的样品制备 电子的穿透能力有限，因此透射电镜采用覆盖有支持膜的载网来承载被观察的样品。最常用的载网是铜网，也有用不锈钢、金、银、镍等其他金属材料制备的载网。而支持膜可用塑料膜（如火棉胶膜、聚乙烯甲醛膜等），也可以用碳膜或者金属膜（如铁膜等）。 ① 负染技术 与将样品本身染色来提高反差的方法相反，负染色技术是用电子密度高、本身不显示结构且与样品几乎不反应的物质（如磷钨酸钠或磷钨酸钾）来对样品进行“染色”。这些重金属盐不被样品成分所吸附而是沉积到样品四周，如果样品具有表面结构，这种物质还能进人表面上凹陷的部分，从而可以通过散射电子能力的差异把样品的外形与表面结构清楚地衬托出来。 负染技术简便易行，病毒、细菌（特别是细菌鞭毛）、离体细胞器、蛋白质和核酸等生物大分子等的形态大小和表面结构都可以采用这种制样方法进行观察。 ② 投影技术 在真空蒸发设备中将铂或铬等对电子散射能力较强的金属原子，由样品的斜上方进行喷镀，提高样品的反差。样品上喷镀上金属的一面散射电子的能力强，表现为暗区，而没有喷镀上金属的部分散射电子能力弱，表现为亮区，其效果就如同太阳光斜射形成的影子，使我们能了解样品的高度和立体形状。投影法可用于观察病毒、细菌鞭毛、生物大分子等微小颗粒。 ③ 超薄切片技术 尽管微生物的个体通常都极其微小，但除病毒外，微弱的电子束仍无法透过一般微生物如细菌的整体标本，需要制作成100nm以下厚度的超薄切片，方能看清其内部的细微结构。此外，从细菌、立克次氏体、螺旋体、病毒等病原体与宿主细胞的关系，对宿主细胞引起的超微形态的改变，以及如病毒对宿主细胞的吸附、进人、繁殖等机理的研究，也都需要将宿主的组织或培养细胞制作超薄切片后才能用透射电镜观察。 可以说，超薄切片技术是生物学中研究细胞及组织超微结构的最常用、最重要的电镜样品制备技术，其基本操作步骤如下。 取样～固定一脱水～浸透与包埋～切片～捞片～染色～观察。 ( 2 ）扫描电镜的样品制备 扫描电镜的结构特点是利用电子束作光栅状扫描以取样品的形貌信息。因此，其样品制备方法比透射电镜要简单，它主要要求样品干燥，并且表面能够导电。对大多数生物材料来说，细胞含有大量的水分，对表面不导电，所以观察前必须进行处理，去除水分，对表面喷镀金属导电层。在这过程中必须始终保持样品不变形，这样，最后的观察才能反映样品本来面目。 保持样品形状的主要关键是样品干燥。干燥方法有自然干燥、真空干燥、冷冻干燥和临界点干燥等。其中临界点干燥的效果最好，其原理是利用许多物质，如液态 CO2 ，在一个密闭容器中达到一定的温度和压力后，气液相面消失（即所谓的临界点状态）的性质，使样品在没有表面张力的条件下得到干燥，很好地保持样品的形态。干燥、喷镀金属层后的样品便可用于观察。 第三节 食品中微生物检测技术 食品中的微生物检验，在食品卫生学中是作为判定食品被微生物污染程度的标志，也可作为观察食品中微生物的性质以及微生物在食品中繁殖的动态，以便对被检的食品进行卫生学评价时提供科学依据。 主要介绍近些年来国际、国内常见的用于食品卫生检测的微生物快速检验方法，以及各类致病菌的初筛检测。 通过了解这些内容，不需要太多的专业培训和经验就可以使基层检验部门和生产厂家的检验人员掌握，把好食品人口前的第一关。在此需要指出的是快速方法并不专指在检测时间上能够提前，还有一些快速方法是用在简化操作上，比如，样品制备、实验准备（培养基、实验器具的改进等）、操作过程的简化或自动化、培养条件的改善等等。 生物的生长一般都需要一定的水分，适宜的温度和合适的营养，微生物也不例外。菌种保藏就是根据菌种特性及保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。 例如利用培养基或宿主对微生物菌株进行连续移种，或改变其所处的环境条件，例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等，令菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态，而在一定时间内得到保存，有的可保藏几十年或更长时间。在需要时再通过提供适宜的生长条件使保藏物恢复活力。 1 ．传代培养保藏 传代培养与培养物的直接使用密切相关，是进行微生物保藏的基本方法。常用的有琼脂斜面、半固体琼脂柱及液体培养等。采用传代法保藏微生物应注意针对不同的菌种而选择使用