利用dna shuffling技术改造抗虫bt基因的研究-study on transformation of insect-resistant bt gene by dna shuffling technology.docxVIP

利用DNAshuffling技术改造抗虫基因Bt的研究中文摘要Bacillusthuringiensis是一类广泛存在于土壤、灰尘、植物、水和昆虫中，革兰氏阳性，在生长的某个时期形成芽孢和伴孢晶体的杆菌。许多具有对鳞翅目、双翅．一●一一一+’～。目、鞘翅目、膜翅目、直翅目特异杀虫活性的Cry蛋白被分离出来。尽管已经有许多有效的突变方法已经用于研究Cry蛋白，但是依然有一定的局限性。本研究就是使用DNAshuming技术来创造一个拥有各种不同突变和突变位点的巨大突变体库。本试验以改造合成的5个历基因(crylAb、crylAc、crylC擎,cry2A和cryYC事)为材料，利用DNAshuffling这一体外分子进化技术，构建了一个含有1000个重组基因克隆的大肠杆菌表达库；通过诱导表达重组蛋白，以棉铃虫为试验昆虫进行蛋白毒性实验。并对这1000个重组克隆进行了测序，通过对这些重组基因与原始5个基因进行序列同源性比较。发现与crylAb，crylAc、crylC*、cry2A·和c,y9c幸具有序列相似性的克隆分别为235个、186个、16个、420个和88个，未知序列55个。1000个重组克隆中筛选到毒性增强的重组克隆主要是与cry2A基因同源。crylAc来源重组克隆组中，表达蛋白杀虫数目高于对照CrylAc的克隆为5个，持平的有2个，毒性降低的为179个，其中完全丧失毒性的克隆有116个。420个来源于cry2A*的重组克隆毒力测定结果显示，杀虫效果明显提高的克隆有132个；毒力持平的克隆有6个；毒力下降的克隆有282个。与crylAb有序列相似性的有235个，在1000个重组克隆中数量居于第二位。其杀虫毒力略低于CryIAe，但是在杀虫数最多的10个重组基因中，也只有1个克隆977来源于crylAb，这一点和crylAc相同。来源于crylC*的重组杀虫蛋白数量最少，仅为16个。这可能是因为该蛋白在基因同源性上与其他4个基因存在较大差异。来源于cry9C*的重组蛋白所占1000个重组克隆的比例为8．8％。相较其他基因也较少。其中来源于cry9C*的重组蛋白绝大部分为失去毒力或者降低毒力。在毒性降低或丧失的克隆中，多数是产生了移码突变导致大量的氨基酸序列的改变，部分则是由于末端序列的移码、提前出现终止密码等因素。而毒性与原始基因相当的克隆则是由于所表达的氨基酸序列没有变异，或者氨基酸突变的位点位于三维结构外侧，对与膜结合的能力和杀虫毒力均没有影响。分析了crylAc和czy2A*-A芒．源的克隆中单氨基酸位点突变对蛋白结构和功能的华中农业大学2000届硕士研究生学位论文影响，发现毒性提高的重组克隆突变位点分布在3个结构域中，但大部分都位于结构域1和2中。突变的位点多为单个氨基酸或相邻的少数几个氨基酸，它们分布在整个蛋白的不同螺旋和折叠中。突变后的氨基酸如R127L、R127F能够提高结构域1的疏水性从而有利于整个三级结构的稳定。还有克隆305、323中的突变如T296H增加了结构域2的正电荷，有利于蛋白与带负电荷的膜受体结合。还观察到了一些突变热点位点，如cryL4c来源克隆中第124、127、296位氨基酸，cry2A·来源克隆中的第12．14、25．28、140．146位氨基酸。DNAshuffling技术提供的这1000个突变体为我们研究重组后基因的突变位点、突变类型对蛋白毒力的影响提供了材料，通过分析该突变氨基酸所在结构域位置和理化性质对整个杀虫晶体蛋白的结构和功能的影响。同时也为转基因抗虫育种提供了新编码的高毒性蛋白的基因。关键词：苏云金芽胞杆菌；DNAshufflingcrylAb；crylAmcrylC*：cry2A·；cry9C·；结构；功能2利用DNAshuffling技术改造抗虫基因研的研究ABSTRACTBacillusthuringiensis(BOisagram-positive，spore-formingbacteriumthatexistsworldwideinsoil，dust,plants，waterandinsectcadavers．Cryproteinsspanawiderangeofinsectorders(Lepidoptera,Diptera,Coleoptera,Hymenoptera,andOrthoptera)．ManymutationtechniqueshavebeenusedtostudyCrytoxins．Althoughvaluable，themutationtechniquesdiscussedinthepreviousparagraphshaveimportantlimitations．Inthepresentstudy，DNAshufflingwasused