硫化叶菌内切β-1,4-葡聚糖酶基因及甘露聚糖酶基因的克隆 表达与功能分析-cloning, expression and functional analysis of endo - β - 1,4 - glucanase gene and mannanase gene in leaf vulcanizing bacteria.docxVIP

硫化叶菌内切3-I，4一葡聚糖酶基凼及甘露聚糖酶基因的克隆、表达与功能分析摘要B一甘露聚糖酶和内切p-1，4．葡聚糖酶是重要的工业用酶，。广泛的应用于饲料业、 造纸业、啤酒工业等领域。为了满足生产的要求，对工业用酶耐热耐酸高活性方面 的研究日益增多。本研究的主要目的是，从极端微生物中挖掘一些有潜在工业价值 的嗜热酶，尝试利用冰岛硫化叶菌蛋白表达系统，探索这些嗜热酶在工业化应用中 的可行性。本研究获得如下结果：(1)利用PCR技术从冰岛硫化叶菌REYl5A(＆islandicus Reyl5A)中分别扩 增得到带有和不带有信号肽编码序列的内切D-l，4．内切葡聚糖酶基因(Sis e一，并将 其克隆至硫化叶菌表达载体pZC2中，构建重组表达载体pZC2一eng—YS和，pZC2．eng。WS，并转化至S．isla．ndicus E233S(zSpyrEFz31acS)。重组菌株经D一阿拉伯 糖诱导后，细胞破碎上清经Ni-NTA柱纯化，得到重组蛋白。SDS—PAGE结果表明 不带有信号肽的葡聚糖酶(ENG．w)分子量为4l ku，带有信号肽的分子量(ENG-SP) 为43 l(u。酶学性质分析表明前者没有酶活性；后者酶活力为103．4 U／L，最适反应 温度为90C，最适pH为4．O，耐热性实验结果表明在90。C保温60 min后酶活力稳 定在最高酶活力的40％以上；金属离子实验结果表明，终浓度为lmmol／L的MIl2+ 对重组酶促进作用最大，使其酶活力提高了约59％，终浓度为1mmol／L的Ca2+对其 抑制作用最强，使其酶活力下降至43％。(2)利用PCR技术从硫磺矿硫化叶菌(s“tfolobus solfataricus P2)中扩增得到 内切甘露聚糖酶基因，并将其分别克隆至大肠杆菌表达载体pET-30a和硫化叶菌表 达载体pZC2中，构建重组表达载体pET-30a-3007和pZC2—3007，并分别转化至Ecoli Rosetta和Sislandicus E233S(Z3pyrEFAlacS)菌中。利用IPTG诱导重组菌株Ecoli Rosetta／pET-30a-3007，SDS．PAGE检测表明目的蛋白大部分以包涵体形式存在且分子量大小为70 l【u，与预测一致；对其进行包涵体复性后过NioNTA柱纯化得到目的蛋白3007．R。重组菌株islandicus E233S／pZC2．3007经D-阿拉伯糖诱导后，细胞 破碎上清经Ni-NTA柱纯化，得到重组蛋白3007．S。酶学性质分析表明重组蛋白 3007．R和3007．S均没有甘露聚糖酶活性，实验结果证实在此实验条件下Ss03007 不具有NCBI上预测的甘露聚糖酶活性。质谱分析重组蛋白3007．S，结果表明基因 序列均全部表达。关键词硫化叶菌；甘露聚糖酶；内切p-l，4一葡聚糖酶；DNS法；表达华巾农业大学201 I届硕士研究生学位论文Abstract13-mannanase and endo一1，4-p—glucanase，as important enzymes，have been widely used in many fields such as animal feed industry,pulp and paper industry and beer industry．In order to meet the need in industrial production，the exploitation ofthermoacidophilic industrial enzymes with high activity is increasing．The main purpose of this study is to find thermophilic endoglucanase and mannase from extremophilic microorganisms，which have potential industrial value．The author tried to use Sulfolobus islandicus protein expression system to explore these thermophilic enzymes for potentialindustrial applications．(1)Endo—D一1，4-glucanase gene(with or without signal peptide coding sequence) Was amplified from Sulfolobus islandicus REYl 5A genomic DNA and inserted into the Sul