克唑替尼关键手性前体s-1-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的酶法制备研究-enzymatic preparation of key chiral precursor s - 1 - 2,6 - dichloro - 3 - fluorophenylethanol of crizotinib.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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克唑替尼关键手性前体s-1-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的酶法制备研究-enzymatic preparation of key chiral precursor s - 1 - 2,6 - dichloro - 3 - fluorophenylethanol of crizotinib.docx

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克唑替尼关键手性前体s-1-2,6-二氯-3-氟苯基乙醇的酶法制备研究-enzymatic preparation of key chiral precursor s - 1 - 2,6 - dichloro - 3 - fluorophenylethanol of crizotinib

上海师范大学硕士学位论文目录目录摘要IAbstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．II目录111英文缩写说明．．VI第1章绪论．．11．1克唑替尼的研究进展．．11．1．1非小细胞肺癌11．1．2克唑替尼11．1．3克唑替尼的临床研究21．1．4克唑替尼的作用机制21．1．5克唑替尼的合成路线51．2手性醇的合成．．61．2．1化学法合成手性醇61．2．2牛物法合成手性醇61．3还原反应中辅酶的循环再生．．71．3．1光化学法81-3．2电化学法再生81，3．3化学法再生81．3．4酶法再生91．4(S)．1一(2，6一二氯一3一氟苯基)乙醇的制备方法111．5立题依据121．6主要研究内容13第2章葡萄糖脱氢酶与乙醇脱氢酶重组表达菌株的构建142．1引言142．2实验材料142|2．1实验仪器．．142．2．2实验试剂．．152．2．3质粒、菌株与培养．．152．2，4主要溶液和缓冲液．．152．3实验方法162．3．1大肠杆菌的培养与保藏．．1623．2CaCl2法制备EcoliDH5a和E．coliBL21(DE3)感受态细胞．．162．3。3转化大肠杆菌质粒一172．3．4碱裂解法抽提大肠杆菌质粒．．172．3．5PCR方法．．17III万方数据目录上海师范大学硕士学位论文2．3．6目的DNA片段的胶回收182．3．7核酸琼脂糖凝胶电泳．．182．3．8DNA的酶切192．3．9DNA片段的连接192．3．10葡萄糖脱氢酶重组质粒的构建192．3．11乙醇脱氢酶重组质粒的构建202．3．】2重组酶蛋白的试表达202．3．13蛋白表达条件的优化202．3．14葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶酶活的测定212．3．15蛋白质浓度的测定222．3．16SDS—PAGE蛋白质电泳的检测222．4结果与讨论232．4．1葡萄糖脱氢酶表达质粒的构建．．232．4．2乙醇脱氢酶表达质粒的构建．．242．4．3重组酶蛋白E．coliBL21一GDH表达条件的优化．．242．4．4重组酶蛋白E．coliBL21．ADH表达条件的优化．．262．4．5E．coliBL21一GDH与E．coliBL21一ADH蛋白质含量的测定282．4．6GDH与ADH酶活的测定．282．5本章小结28第3章葡萄糖脱氢酶与乙醇脱氢酶共表达的研究303．1引言303．2实验材料303．2．1实验仪器一303．2．2实验试剂．．303．2．3菌株、质粒与培养基～303．3实验方法3l3．3．1共表达重组菌株的构建．．313．3．2EcoliBL21一ADH／GDH共表达条件的优化313．4结果与讨论323．4．1双质粒共表达菌株E．coliBL21．ADH／GDH的构建323．4．2共表达重组菌E．coliBL21一ADH／GDH表达条件的优化333．4．3SDS—PAGE检测表达蛋白．．353．5本章小结36第4章乙醇脱氢酶与葡萄糖脱氢酶偶联催化制备(S)一1一(2，6一二氯一3一氟苯基)乙醇．．：；74．1引言374．2实验材料374．2．1实验仪器．．37万方数据上海师范大学硕士学位论文目录4．2．2实验试剂．．384．3实验方法384．3．1双酶偶联催化制备(S)．1一(2，6．二氯．3．氟苯基)乙醇384．3．2双酶共表达催化制备(s)．1．(2，6．二氯一3．氟苯基)乙醇．．384．3，3反应条件对制备(S)．1．(2，6-二氯．3一氟苯基)乙醇的影响．．394．3．4转化产物的小量分离一404．3．5转化产物的分析一4l4-3．6转化产物含量的测定．．414．3．7共表达重组菌E．coliBL21一ADH／GDH的罐发酵培养424．3．8共表达重组菌体系的放大转化一434．4结果与讨论．444．4．1底物投料量对转化率的影响一444．4，2pH对转化率的影响444．4r3温度对转化率的影响．．454．4．4葡萄糖添加量对转化率的影响一464．4．5硫酸镁添加量对转化率的影响．．464．4．6反应时间对转化率的影响．．474．4．7转化产物的检测一474．4．8酶表达方式对转化体系的影响．．494．4．9共表达重组菌E．coliBL21．ADH／GDH的罐发酵培养504．4．10共表达重组菌体系的放大转化504．5本章小结．5l第5章结论与展望525．1结论．525．2展望52参考文献～53附录58攻读学位期间取得的研究成果．．59致谢．．．60论文独创性声明．．61V万方数据英文缩写说明～．土塑堡蔓丕堂堡主兰垡堡塞英文缩写说明英文缩写英文全称中文释义NADHNicotinamideadeninedinucleotidereduced还原型辅酶INADPHTrip