2010实验九十 离子交换层析和考马斯亮蓝染色.pptVIP

一、层析法（色谱法）概念 二、层析法分类 2、根据流动相的形式分类 液相层析：流动相为液相； 气相层析：流动相为气相。 3、按分离原理分类 各类层析的原理和载体 三、 离子交换层析（ion-change chromatography） 1. 原理 离子交换层析是用离子交换剂（具有离子交换性能的物质）作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。 即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。 广泛用于蛋白质、氨基酸、糖类等的分离纯化。 带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。 2.步骤 3. 离子交换剂的种类 在惰性载体上引入带有电荷的活性基团即离子交换剂。 （一）按活性功能基团带电荷性质不同 阳离子交换剂 — 带负电荷，与阳离子交换 阴离子交换剂 — 带正电荷，与阴离子交换 （二）按载体种类不同 1.离子交换树脂：主要有聚苯乙烯树脂 苯乙烯+二乙烯苯 ? 聚苯乙烯 （单体）（交联剂） 二乙烯苯 交联度 = ———————— × 100% 苯乙烯 + 二乙烯苯 交联度大，网孔变小，大分子量的离子不能进入树脂颗粒内发生离子交换。 在不影响分离的情况下，以采用交联度较高的树脂为好，这样可以提高树脂对离子的选择性 。 目数：一般定义为筛网每英寸(25.4mm)长度上所具有的网眼数。这里反应的是离子交换树脂的颗粒直径大小，目数越大，颗粒直径越小。 Dowex 50 为20-50目 Dowex 20 840?m 50 297?m 100 149?m （代表二乙烯苯的百分含量） 树脂resin的分类（据所含交换基团的性质分）： 阳离子交换树脂 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H) 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 阴离子交换树脂 强碱 含季胺基团 [-N+(CH3)3] 弱碱 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2 阴离子交换树脂对化学试剂及热都不如阳离子交换树脂稳定。 2.离子交换纤维素 阴离子交换纤维素 —如:DEAE-纤维素 pH8.6以下分离中性或酸性物质,聚二乙胺乙基 阳离子交换纤维素—如:CM-纤维素 一般pH4条件下使用,具有羧甲基 3.离子交换凝胶 — 分离大分子物质 如：葡聚糖（Sephadex）、 聚丙烯酰胺（PAG）、琼脂糖（Sepharose） 4. 操作注意点 （一）离子交换剂的选择 原则：根据被分离物质的性质选择—同一性质离子交换剂中选用对被分离物质各组分之间结合力差异大的型号交换剂，以保证通过离子交换层析后能得到比较满意的结果。 考虑因素： 1.被分离物质带何种电荷 2.被分离物质分子的大小 大分子物质选用凝胶，其次选用纤维素 3.被分离物质所处的环境 4.被分离物质的物理化学性质 5.被分离物质的大概数量 根据分离过程的实验条件： 1.强酸强碱—应用广泛 2.弱酸型—只能在碱性pH范围内使用 3.弱碱型—只能在酸性pH范围内使用 （二）缓冲液的选择 原则：不能发生化学反应，所带电荷应与样品一致。避免使样品变性 (三)洗脱剂 原则：所用洗脱液比吸着物质具有更活泼的离子或基团 改变pH或离子强度 ?增强洗脱液与离子交换剂的结合力 ?降低分离物与离子交换剂的结合力 洗脱方式：梯度洗脱 5. 应用 分离多肽蛋白、氨基酸、核酸及其他带电的 生物分子。 离子交换层析浓缩蛋白质溶液 材料：本次实验使用DEAE－纤维素DE-52，是阴离子交换树脂。 目的：离子交换层析浓缩蛋白质溶液(每组一柱) DE-52预处理：将DE-52在蒸馏水中浸泡过夜，充分溶涨，然后倾去上清，加入过量的0.02mol/L pH8.0磷酸盐缓冲液浸泡1小时，真空抽气。 试剂配制： Na2HPO4.12H2O 71.64 g 定量至1 L （0.2mol/L Na2HPO4） NaH2PO4.2H2O 31.21 g 定量至1 L （0.2mol/L NaH2PO4） 91.5ml Na2HPO4 ＋8.5ml NaH2PO4 加水定量至1L，配成0.02mol/L pH