生化课件第二十一章 DNA重组及重组DNA技术知识.pptVIP

DNA重组和重组DNA技术 DNA Recombination and Recombinant DNA technology;起初上帝创造天地， 地是空虚混沌，渊面黑暗， 上帝的灵运行在水面上， 上帝说：“要有光，就有了光。” ------《旧约全书·创世纪》;第 二 节 重组DNA技术;本节主要内容;重组DNA技术 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质DNA与载体DNA接合成一具有自我复制能力的重组DNA分子——复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称分子克隆或重组DNA 技术 。 ;酶切后的目的基因片段;;;;基因克隆的基本步骤; 限制性核酸内切酶 连接酶 聚合酶(Taq酶、末 端转移酶) 多聚核苷酸激酶 碱性磷酸酶;1. 限制性核酸内切酶 （restriction endonuclease, RE）;第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构(palindrome) ;在对称轴中心同时切割双链，产生平末端或称钝性末端（blunt end），如Hpa I：; 在对称轴两侧相对位点分别切割一条链。从 5端切割产生5 端突出的粘性末端，如EcoR Ⅰ ：;限制性内切酶作用过程; 1．在下述双链DNA序列(仅列出其中一链序列)中不属于完全回文结构的是 A．AGAATTCT B. TGAATTCA C．GGAATTCC D．CGTTAAGC E．AGATATCT;常用的载体按来源分为： 质粒（plasmid）、噬菌体(phage)和病毒(virus);载体的选择标准;质粒（plasmid）;;λ噬菌体 λ噬菌体是大肠杆菌的噬菌体，它由外壳蛋白和λ-DNA组成 。λ噬菌体（lambda bacteriophage）DNA，为线性双链DNA，它的两端各有12个碱基的互补粘性末端，称COS位点。当噬菌体侵入宿主细胞，两个粘性末端互补结合，形成环状分子。λDNA在体外可包装成病毒颗粒，并高效感染大肠杆菌。 ;lacZ’基因: 编码?-半乳 糖苷酶的?-片段;酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）;三、重组DNA技术基本原理及操作步骤; 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程;（一）目的基因的获取;* 化学合成法获取目的基因;组织或细胞染色体DNA;mRNA ;cDNA文库的特点 ◆代表了取材当时所表达基因的总和，不包括那些未表达的基因。 ◆mRNA分子中不包括内含子及调控序列，所以cDNA文库的复杂性要比基因组文库低的多。 ;体外高效、快速、特异地扩增目的基因或DNA片段的技术。 其原理类似于DNA的体内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物， dNTPs ,DNA聚合酶，合适的缓冲液系统(Mg2+)和DNA变性、复性(退火)及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增 .;5?;Cycle 3;DNA片段;（三）外源基因与载体的连接;粘性末端连接;DNA连接酶的作用过程;Bam HⅠ切割反应;不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接;2. 平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平末端的补齐;3. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 如将poly（dA）加到双链DNA片段3’ 羟基上，而将poly（dT）加到质粒载体3’ 羟基上，制造出粘性末端，然后通过退火进行粘性末端连接。 ;受体菌条件 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态(competent) ;;连接;1）抗药性标志的选择(插入失活法);2）标志补救（?-半乳糖苷酶法）;;;; 指用探针检测样品中未知核酸序列，通过碱基互补配对原则发生同源性结合，再经显影或显色的方法，将结合的核酸序列的位置或大小显示出来。;菌落原位杂