生物技术知识第六章 基因分离与克隆.ppt

4. mRNA差异比较为基础的分离法 Mutant and wild-type 表型差异： 不同基因型目标基因在细胞总DNA中所占比例很小。mRNA仅代表那些在基因组中能够表达的基因顺序。 同一材料不同时空背景、不同环境响应下mRNA表达可能不同 4. mRNA差异比较为基础的分离法 差异显示(mRNA differential display) DDRT-PCR (difference display RT-PCR) 差减杂交Subtractive　Hybridization 代表性差异分析（Representational Difference Analysis，RDA ） 抑制性差减杂交（Suppression Subtractive Hybridization， SSH 竞争性杂交（ Competitive Hybridization） Reverse Transcription PCR Amplification Denaturing Polyacrylamide Gel CAAAAAAAAAAAA-An TAAAAAAAAAAAA-An GAAAAAAAAAAAA-An 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’(H-T11G) dNTPs MMLV reverse transcriptase CAAAAAAAAAAA-An GTTTTTTTTTTTCGAA 5’-GCTTGATGCC-3’(H-AP-1 Primer) 5’-CTTTTTTTTTTTG-3’(H-T11G) dNTPs a-[33P-dATP] Taq DAN polymerase GCTTGATGCC GTTTTTTTTTTTCGAA X Y Differential Display ①3’端有12种组合锚定引物 ②10核苷酸引导第2链合成 ③两引物扩增产物差异 Subtractive Hybridization Samples of Interest mRNA Extraction Reverse transcription Hybridization cDNA RNA cDNA cDNA RNA RNA ①生物素标记 ； ②cDNA与RNA复合体 抑制消减杂交 Suppression Subtractive Hybridization (SSH) 2次PCR 1st接头外侧（5‘）作引物； 2nd：接头内侧（3‘）作引物 应用的几个关键点： ①tester与driver配对密切，最好双方是同源细胞株，这样双方才具有高度可比性，筛选出的差异表达基因才可能与表型关系密切．从而减少工作量，减少下一步工作的肓目性。 ②在选用限制酶时应尽量选用对于基因组DNA中酶切位点较少的限制酶，使酶切后产生的片段尽量大—些。例如使用Rsa I可产生600 bp左右的片段，这样既可防止过长的cDNA片段影响杂交效率，也可提高每个基因的代表性。 ③接头的设计上。接头要含有酶切仿点以连于平端cDNA上，重要的是要在其末端含有一段反向重复序列，这使得在PCR反应中能选择性扩增目的cDNA片段，同时抑制非目的cDNA片段的扩增，即抑制PCR技术。 优点： 特异性强 假阳性率低 高敏感性，检出低丰度mRNA 速度快，效率高 缺点 mRNA用量高 得到的是cDNA片段 研究材料之间不能差异太大 5、利用EST数据库发现新基因 EST (expressed sequence tags),是从基因表达的短的序列，携带着完整基因某些片断的信息，称为表达序列标签 获得一个EST的途径有三种：1 大规模测序；2 比较同源性；3 差异显示或基因芯片法获得与某一性状相关的EST 电脑克隆 第一步，找到与待克隆基因相关的EST；第二步 计算机拼接、比较；第三步 检测潜在的可读框ORF确定是否为全长 6. SAGE Expression Level Expression Level Gene Products Gene Products Quantify Tags and Determine Patterns of Gene Expression Link tags together and sequence Isolate SAGE tags AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA AAAAA Sample A Sample B Serial analysis of gene expression SAGE 7.基因芯片（gene chip）技术 生物芯片（Biochip）:是指通过机器人自动印迹或引导光化学合成技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生物分子微列阵，根据分子间的特异性相互作用的原理，