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微生物转化穿山龙根茎水提取物初步研究 　　摘要:文章利用由穿山龙根茎中分离得到的菌种对穿山龙根茎水提液进行转化,比较转化前后水提液抗炎活性。结果表明,转化后发酵液抗炎活性明显强于发酵前。 　　关键词:穿山龙根茎;微生物转化;抗炎活性 　　中图分类号:Q93-3 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-08-0061-2 　　 　　0 前言 　　穿山龙为薯蓣科植物穿龙薯蓣(Dioscorea nipponica Makino)的干燥根茎,收载于《中国药典》,其主要有效成分为薯蓣总皂苷,薯蓣总皂苷的水解产物薯蓣皂苷元(diosgenin),化学名为Δ5-异螺旋甾烯-3-β-醇[1]。穿山龙应用历史悠久,我国传统医学认为其具有活血舒筋、祛风止痛等功效,用于治疗腰腿疼痛、筋骨麻木、风寒湿痹和跌打损伤等症[2]。目前对中药穿山龙的应用多是采取不同的物理化学方法提取其有效成分薯蓣皂苷元,但提取率不高,如郭盛磊等利用超声波辅助提取[3],提取率仅为19.37%,这样造成其有效成分的浪费。 　　微生物转化中药是利用微生物体系产生的酶对外源性中药底物进行结构转化的生物化学过程[4]。微生物具有酶系广泛、反应选择性强、反应条件温和等优点,利用微生物进行中药转化,可以提高药效、产生新的活性成分、降低中药不良反应等[5]。转化的研究对象包括中药中的醌类、苯丙素类、黄酮类、萜类、三萜类、甾体及生物碱类等几乎所有类型的中药成分[6]。对皂苷类药物转化研究很少。 　　本文用由穿山龙根茎中分离得到的菌种对穿山龙根茎水提液进行转化,比较转化前后水提液抗炎活性。 　　1 实验材料与方法 　　1.1 实验材料 　　穿山龙根茎:购于鸡西中药房;菌种:由穿山龙中分离得到;小鼠:55只。 　　PAD斜面培养基[7]:去皮马铃薯200g,葡萄糖20g,水1000mL,琼脂20g。 　　帅选平板培养基:穿山龙根茎粉末水提取液,添加适当琼脂。 　　转化培养基:穿山龙根茎干粉过40目筛,添加适当比例水分。 　　1.2 实验方法 　　1.2.1 穿山龙根茎水提液制备 穿山龙根茎粉碎成末,配成质量浓度为10%、15%两种溶液并灭菌。 　　1.2.2 菌种分离与纯化 获得单菌落:药材放置约l-2月左右,表面布满孢子,取少许长满孢子的穿山龙根茎于无菌水中振荡摇匀,制得孢子悬液。取0.5ml进行梯度稀释,取10-7、10-8、10-9三个稀释度菌悬液各涂布三个筛选平板基。置28℃恒温条件培养3-4天,取出平板观察,平板中生长大量单菌落。 　　菌种纯化培养:挑取典型单个菌落进行纯培养。分纯后的菌株接种于试管斜面保藏,并同时进行发酵研究。 　　1.2.3 发酵转化实验 分别取实验1.2.2中所得1-8号单菌落,用0.5cm直径打孔器沿平板菌种外围打孔;然后接入浓度为10%的穿山龙根茎水提液中,每瓶6片,并于28℃下摇床培7天,得转化后发酵液。 　　1.2.4 抗炎活性测定 穿山龙根茎水提物抗炎活性测定:取穿山龙根茎水提取物10mL,用15只小鼠,每种试液设五个平行实验,进行醋酸致小鼠腹腔毛细血管渗出实验,检验其抗炎效果。 　　发酵产物抗炎活性测定:分别1.2.3发酵转化实验转化后发酵液10mL,每组发酵液设五个平行,进行醋酸致小鼠腹腔毛细血管渗出实验,检验发酵产物的抗炎效果。 　　醋酸致小鼠腹腔毛细血管渗出实验:取小鼠,禁食12h、不禁水,随机分组,并设阳性对照阿斯匹林组和空白对照组,每组5只小鼠。各组小鼠分别灌胃给药,给药容积25g生药/kg.d,阳性对照阿斯匹林组7.5mg/kg.d,空白对照组给予等容积蒸馏水,连续7天。末次给药后40min,每只小鼠尾静脉注射0.5% 的依文思蓝生理盐水溶液0.2mL,并立即腹腔注射0.6% 醋酸溶液0.2mL,20min后处死动物。生理盐水5mL轻揉腹部3s,5min后剪开腹部皮肤和肌肉,用吸管吸取腹腔液,3000r离心15min,取上清液,采用721分光光度计于590nm处测定吸光度[8]。 　　2 实验结果 　　2.1 菌种分离与筛选 　　从分离平板中观察所得单菌落,由孢子颜色看,主要为黑、黑红、黑绿孢子等几种,如下表1所示。 　　表1 挑选菌种形态观察 　　编号 1 2 3 4 5 6 7 8 　　孢子外观 暗绿 暗黄绿 黄绿 暗绿 黑绿 黑红 黑色 黑黄 　　 　　挑取1-8号单菌落保存,并同时将各单菌落接种于穿山龙培养基中进行发酵。 　　摇瓶发酵观察,2天左右产生白色菌球。继续发酵菌球随时间增多,并不断增大。发酵液随时间加长,逐渐变黏稠,推测随着菌球的生长,产酶的大量积累,药材中大量成分被酶解,从而发生组织成分的变化以及有效成分的不断溶出,进而实现目标产物的转