抗人类成纤维细胞生长因子受体2fgfr2的单链抗体的筛选-screening of single chain antibodies against human fibroblast growth factor receptor 2 fgfr 2.docxVIP

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2018-05-29 发布于上海
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抗人类成纤维细胞生长因子受体2fgfr2的单链抗体的筛选-screening of single chain antibodies against human fibroblast growth factor receptor 2 fgfr 2

汕头大学硕士学位论文汕头大学硕士学位论文 I I 摘要人类成纤维细胞生长因子受体 2（FGFR2）及其配体在胚胎发育及组织生长中都扮演着重要的角色，对细胞的增殖、分化、迁移等都有着重要的作用。FGFR2-Ⅲb 亚型在上皮细胞中表达,有证据表明 FGFR2-Ⅲb 的过量表达与癌症发展相关。本课题研究的主要内容是通过酵母双杂交技术从一个单链抗体（Single-Chain Variable Fragment，scFv）文库中筛选出能与 FGFR2-Ⅲb 胞外段相互作用的 scFv，并准备利用哺乳动物双杂交方法进一步验证两者的相互作用。从而为抑制有 FGFR2 过量表达的肿瘤细胞的增殖以及癌症治疗奠定一定的基础。本课题的研究主要包括以下几个方面:（1）从 Genbank 中查询 FGFR2-Ⅲb 基因并获得能与 FGFs 结合的胞外段 cDNA 序列信息，由公司合成 cDNA 后，将 cDNA 连接到酵母双杂交诱饵质粒 pGBKT7 中，形成 pGBKT7-FGFR2；（2）将 pGBKT7-FGFR2 质粒转化酵母细胞 AH109；（3）扩增含有单链抗体 cDNA 的猎物质粒文库 pSF50-scFv 以及提取文库质粒；（4）将单链抗体文库转化入已含有 pGBKT7-FGFR2 的 AH109，进行酵母双杂交实验；（5）提取阳性 AH109 克隆的质粒，转化大肠杆菌 DH5α，在氨苄青霉素平板上生长，从而获得带有 pSF50-scFv 的 DH5α，提取 pSF50-scFv 质粒，对阳性克隆的 scFv DNA 测序并分析和比较抗体片段的 DNA 序列；（6）将阳性克隆的 scFv DNA 回转入已含有 pGBKT7-FGFR2 质粒的 AH109，进一步验证两者的相互作用；（7）设计引物将 FGFR2 胞外段扩增后连接至哺乳动物双杂交质粒 pACT 内,设计引物将阳性 pSF50-scFv 的 scFv 片段扩增后连接至哺乳动物双杂交质粒 pBIND 内，为进行哺乳动物双杂交实验做准备，以验证 FGFR2 与筛选得到的 scFv 在哺乳动物细胞中的相互作用。本课题经过酵母双杂交得到 18 个 scFv 阳性克隆，通过 DNA 测序和分析表明有 9 个不同的阳性克隆，FGFR2 和 9 种通过酵母双杂交筛选所得的 scFv 片段已克隆至相应的哺乳动物双杂交质粒 pACT 和 pBIND 中形成 pACT-FGFR2 和 pBIND-scFv，为即将展开的下一步检测做好准备。关键词：FGFR2；癌症；scFv；酵母双杂交；哺乳动物双杂交 I II Abstract Fibroblast growth factor receptor 2 （ FGFR2 ） and its ligands play an important role in embryonic and tissue development and growth, and have significant functions on cell proliferation, differentiation and migration. FGFR2-Ⅲb is expressed in epithelial cells, and over-expression of FGFR2-Ⅲb is associated with some cancers. This study used yeast two hybrid system to find single-chain variable fragments（scFv） which interacted with FGFR2 by screening a scFv library, and the interaction between FGFR2 and scFv will be confirmed by mammalian two hybrid system. scFv could be used to inhibit the growth of cancer cells which over-express FGFR2 and inhibit cancer development. This thesis includes the following steps: (1) The extracellular domain cDNA sequence of FGFR2 was found in Genbank, and the cDNA fragment was synthesized by a biotechnology company. Then cDNA fragment w