孔雀石绿多克隆抗体的制备及其快速检测方法的分析-preparation of polyclonal antibody against malachite green and analysis of its rapid detection method.docxVIP

孔雀石绿多克隆抗体的制备及其快速检测方法的研究摘要孔雀石绿是一种合成的有毒三苯基甲烷类化合物，因具有预防和治疗水产动物真菌性 疾病的作用，且价格低廉操作方被便，广泛使用在水产养殖，临床试验研究表明孔雀石绿 对动物器官具有高毒性、高残留、致畸、致癌、致突变的副作用，因此研究一种能够快速 检测孔雀石绿的 ELISA 方法，对水产品的安全检查具有一定的实际意义。本研究在分析孔雀石绿分子结构和免疫原性的基础上，合成羧基化孔雀石绿半抗原，半抗原与载体蛋白偶联合成孔雀石绿人工抗原，用人工抗原免疫兔子获得孔雀石绿多克隆 抗体，将孔雀石绿多克隆抗体进行纯化后用于间接 ELISA 并对其条件进行优化，从而建立 间接 ELISA 快速检测孔雀石绿的方法，主要研究结果如下：1.通过化学方法，由原料 4-甲酰基苯甲酸和 N,N-二甲基苯胺合成羧基化隐色孔雀石绿（CLMG），再将其氧化生成羧基化孔雀石绿（CMG），分别采用活性酯法和碳二亚胺法 偶联羧基化孔雀石绿（CMG）获得人工免疫原（CMG-BSA）和人工包被原（CMG-OVA）， 利用紫外分光光度法测得半抗原与载体蛋白偶联比分别为 13.8：1(CMG-BSA)和 17.1： 1(CMG-OVA)。.用免疫原(CMG-BSA)免疫动物，第 4 次免疫后用间接 ELISA 法初步测定兔子抗血清 效价为 1：3500，抗血清 IC50 值为 40.44 ng/mL。.通过辛酸-硫酸铵法对免疫血清进行纯化处理，经 SDS，表明纯化后的多克隆抗体纯度较高，通过紫外分光光度法测定纯化后的多克隆抗体浓度为 11.02 mg/mL。通过 方阵滴定法确定包被原和纯化抗体的最佳稀释倍数分别为 1：1000，1：8000。4. 在此基础上对包被溶液的选择、包被条件、封闭溶液的选择、封闭条件、竞争时间、 MG 标准溶液与多克隆抗体体积比及抗体稀释液进行优化，经过条件优化后重新建立 MG 标准曲线，获得标准曲线方程 y = -42.44x + 71.08，R2 = 0.985。经计算 MG 的半数抑制率 IC50 为:3.2ng/ mL，检测限（IC90）可达 0.35 ng/mL。孔雀石绿与结构类似物隐色孔雀石绿（LMG）、结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV）的交叉反应率分别为 13.3%、100%、11.4%，鱼肉及水质样品回收率均在 70%以上，回收率高，变异系数均在 10%以下，重复性高，为 孔雀石绿 ELISA 快速检测试剂盒的开发奠定了基础。关键词 孔雀石绿，羧基化，人工抗原，多克隆抗体，间接竞争酶联免疫法The preparation of malachite green polyclonal antibody and the research of its rapid detection methodsAbstractMalachite green is a kind of toxic compounds that synthesis of triphenyl methane. For its inexpensive and easy to operate, as well as its function in the prevention and treatment of aquatic animal fungal diseases, malachite green is widely used in aquaculture. However, clinical and experiments reported that malachite green has high toxicity, high residue, teratogenic, carcinogenic and mutagenic effects on organs. Thus, an ELISA method that can instantly detect malachite green has practical significance to inspect the safety of aquatic products.The study, based on the analysis of the molecular structure of malachite green and immunogenicity, synthesized carboxylate haptens malachite green, and hapten coupled with carrier protein to artificial malachite green antigen. This artificial antigen was used