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液相色谱基础知识 液相色谱基础知识 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法又称高压液相色谱法。它是在经典色谱和气相色谱法的基础上发展起来的，在色谱理论方面没有本质的差别。但由于采用了高效固定相、高压输液泵、高灵敏度检测器等新技术，因而有了更高的效率并实现了自动化。 液相色谱：以液体作为流动相的色谱分离方法 适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析 流动相具有运载样品分子和选择性分离的双重作用 气相色谱：以气体作为流动相的色谱分离方法 适用于沸点较低、热稳定性好的中小分子化合物的分析 流动相只起运载样品分子的能力 液相色谱基础知识 与气相色谱比较，液相是以溶剂作为流动相，流动相参与分离作用，分离能力强；适用范围广，气相色谱分离分析的化合物只占化合物的30％，而高效色谱对高沸点、热不稳定、大分子量、离子型化合物等都有效，适合于生命物质的分析；分析过程中一般不破坏物质，因而可以方便地制备色谱纯物质。 液相色谱基础知识 反相液相色谱（RPC） 流动相极性大于固定相极性 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液。常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右. 液相色谱基础知识 正相液相色谱(NPC) 流动相极性小于固定相极性 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂,常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间.常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 一、色谱起源 二、定义 色谱法：利用组分在两相间分配系数不同 而进行分离的技术 移动相：携带样品流过整个系统的流体 固定相：静止不动的一相，色谱柱固定液 液相色谱流程图 采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配 过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响： 1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动 无在线脱气应注意： 　每天脱气 岛津VP系列输液泵 LC-10ADVP / LC-10ATVP工作原理 液相色谱基础知识 梯度洗脱形式： 线性梯度：在梯度洗脱时，流动相强度的变化和时间成线性比例 指数梯度：在梯度洗脱时，流动相强度随时间的变化呈指数关系 折线梯度 进样器 自动进样器 手动进样器 原理：（六通阀） 注入方式： 1）全量注入 2）部分注入 交叉污染的原因 手动进样法 一般的方法 1.在进样状态下清洗针口 2.在装填状态下插入微量注射器 3.注入样品 4.切到进样状态 手动进样法 便捷的方法（不需清洗） 1.进样状态下插入微量注射器 2.切到装填状态 3.注入样品 4.切回到进样状态 柱温箱 分析结果重现性好 提高柱效 降低柱压 保证检测稳定性 柱压低于150kgf/cm2 柱温在40℃左右，最高使用温度为50℃ 缓冲液PH使用范围为2～7 流动相有机溶剂比例过低, 柱效下降快 常用检测器 紫外检测器（包括二极管阵列检测器） 荧光检测器 示差折光检测器 电导检测器 原理：基于被分析组分对特定波长紫外光的选择性吸收 定量基础：比耳定律，A＝KCL 优点： 1）灵敏度高 2）对温度和流速不敏感 3）可用于梯度洗提 缺点：仅适用于测定有紫外吸收的物质 二极管阵列检测器（SPD－M10AVP） -二十一世纪标准紫外检测器 色谱定性依据： 保留时间 常规紫外检测器 峰纯度 二极管阵列检测器 1）采集三维谱图 2）峰纯度检验 3）光谱库检索 4）可以发现单波长检测时未测到的峰 原理：连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。 优点：通用型检测器， 缺点： 1）对温度变化敏感 2）对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测 3）属于中等灵敏度的检测器 原理：根据物质在某些介质中电离后所产生的电导变化来测定电离物质含量。广泛应