两株den-two den strains.docxVIP

1前言登革病毒(Denguevirus，DEN)属于黄病毒科黄病毒属，有4种血清型，可引起登革热(Classicaldenguefever，DF)、登革出血热(Denguehemorrhagicfever,DHF)和登革休克综合征(Dengueshocksyndrome，DSS)[1]。全球每年估计约有5千万-1亿人感染DEN,有超过50万人出现DHF/DSS[2]。DHF/DSS的临床表现主要为凝血障碍、血小板减少、血浆渗漏、血管病变等。目前，DEN感染内皮细胞使其功能紊乱，导致血浆渗漏的病理机制仍还不完全清楚[3]。DEN基因组为单股正链RNA，长约11kb,由单一的开放读码框编码3种结构蛋白（C、PrM、E）及7种非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）[4]。其中，NS1蛋白在DEN感染和复制过程中起着重要作用[5]。本课题组于1996年从一名发热病人血清中分离到一株DEN-2（B株，下同），经基因测序结果表明，B株与NGC株在NS1基因区核苷酸序列共有7个位点发生碱基突变，在此基础上构建DEN-2的pcDNA3.1（+）-B-NS1和pcDNA3.1（+）-N-NS1重组质粒，利用其经肌肉注射方式免疫BALB/c小鼠，观察其对免疫应答的影响。体外实验指出，内皮细胞是DEN的靶细胞[6]。血管内皮细胞可合成分泌多种自体活性物质，对血管张力的调节发挥重要的作用，其中以NO作用最为重要[7]。NO对舒张血管、血小板聚集、血管生成等方面发挥作用[8,9]，其可穿过内皮细胞膜，导致血管扩张。正常生理条件下，NO在维持心血管系统稳态方面起着十分重要的作用[10]。LevyA等研究表明，DF和DHF病人NO、TNF-α、IL-6等水平增加，表明NO、TNF-α、IL-6与DEN感染有关[11]。模式识别受体包括TLRs和RLR（RIG-I和Mda5），可启动固有免疫应答[12]。研究发现，TLR3、TLR7、TLR8和TLR9定位于细胞内涵体，其它TLR主要表达在细胞膜表面[13]。而RLR定位于线粒体[14]。其中，TLR3被认为在抗病毒过程中起着非常重要作用，其可识别dsRNA病毒或病毒复制中间产物dsRNA[15]。此外，poly(I:C)是一种稳定合成的dsRNA模拟物，作为TLR3配体，可启动TLR3信号通路[16]。TLR3与dsRNA结合后，IRF3分子C端丝氨酸残基磷酸化，使IRF3形成同源二聚体，再与CBP(CREBbindingprotein)／P300181结合形成三聚体，由胞质进入胞核，启动I型IFN的转录，建立抗病毒状态[17]。JormaTissari等研究发现，经IFN-α预处理后可增强poly(I:C)诱导TLR3、I型IFN等在HUVEC中的表达[18]。文献报道，关于DEN免疫逃逸机制，大多与Ⅰ型干扰素信号传导受抑制有关[19]。研究表明，与登革病毒同属的西尼罗病毒(WNV)NS1可通过TLR3信号通路抑制IFN-β和IL-6等的表达[20]。此外，DEN的非结构蛋白可以阻断IRF3磷酸化和下调JAK/STAT通路主要成分的表达，从而抑制Ⅰ型干扰素基因的激活[21、22]。JuanR等研究结果显示，DEN-2感染moDC后可阻断IRF3的磷酸化，从而在抵抗病毒过程中减少Ⅰ型干扰素的产生[23]。基于以上研究，为了探讨NGC、B株DEN-2NS1基因部分序列在人人脐静脉内皮细胞（Humanumbilicalveinendothelialcells，HUVEC）中表达后与NO分泌水平及TLR3-pIRF3-IRF3通路之间是否存在关系，本研究利用已构建NGC、B株DEN-2NS1基因部分序列pcDNA3.1（+）重组质粒，经脂质体转染法将其转染至HUVEC，G418筛选形成克隆细胞，检测NGC、B株NS1基因转染和未转染细胞所分泌NO浓度水平，并用poly(I:C)启动TLR3相关信号转导，检测TLR3、pIRF3及胞核内IRF3蛋白表达情况，初步探讨NGC、B株NS1基因在HUVEC中表达后对NO分泌及TLR3相关信号转导的影响。2材料与方法2.1材料2.1.1重组质粒与细胞登革2型病毒B株与NGC株NS1基因部分序列（第589~1002nt，413bp）重组质粒（pcDNA3.1（+）-B-NS1和pcDNA3.1（+）-N-NS1）由本教研室保存；HUVEC购自上海拜力生物公司。以上重组质粒和细胞由本室按常规方法保存。2.1.2工具酶与试剂盒限制性内切酶HindⅢ、DNAMarkers、loadingbuffer为Takara公司原装产品；RT-PCR试剂盒、PCR扩增试剂盒为Invitrogen公司原装产品；质粒提取试剂盒为Axygen公司原装产品；DAB