大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元凋亡机制研究.docVIP

大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元凋亡机制研究 　　摘要：目的 研究大鼠全脑短暂缺血再灌注后海马CA1区椎体神经元的死亡机制。方法采用经典的四血管夹闭法制作大鼠全脑缺血再灌注模型，取缺血再灌注后不同时间（6 h、24 h、48 h）的海马CA1区脑组织，用ELISA检测Caspase-3的活性变化。同时运用免疫印记方法检测PKC、NMDA受体NR2A及NR2B亚基磷酸化水平的变化。结果 与对照组相比，Caspase-3检测显示缺血再灌注6 h、24 h、48 h海马CA1区椎体神经元呈现逐渐凋亡增多的迟发性死亡。磷酸化蛋白激酶C在缺血6 h即有明显增高，并且于24 h、48 h达到表达高峰（P 　　关键词：脑缺血再灌注；NMDA受体；神经元；凋亡；大鼠 　　中图分类号：R743.31 R258.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）07-0848-03 　　 　　目前对缺血后脑损伤的机制尚未阐明，临床上也无理想的治疗手段［1,2］。海马CA1区锥体神经元对于缺血性损伤特别敏感。在缺血再灌注过程发生过程中，如果缺血过程较为短暂，则细胞死亡主要表现为迟发性的神经元死亡，即凋亡［3,4］。NMDA受体过度激活或不受调控的活化已经被证实牵涉在诸如脑中风、脑创伤等许多急慢性中枢神经系统病症中，并介导了兴奋毒性神经元死亡［5-11］。NMDA受体特异性拮抗剂的使用，发挥了不同程度的缺血再灌注后保护作用蛋白激酶C，属于丝氨酸/苏氨酸激酶的家族成员，在记忆的形成、诱导LTP和突触囊泡的释放中发挥着关键性的作［12］。用［13］。NMDA受体是PKC的潜在作用靶点，PKC可以使NR1、NR2B、NR2B等NMDA受体亚基发生磷酸化而活化［14,15］。钙调节蛋白酶Ⅱ（Calmodulin,CaMⅡ在神经元损伤继而发生的钙离子大量内流中发挥着重要作用，其与NMDA受体亚基NR2B亚基形成的复合物在神经元损伤中发挥着重要的作用。本研究旨在研究大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区NMDA受体NR1、NR2A、NR2B亚基的磷酸化水平变化及其与神经元死亡之间的关系，探索这种表达变化可能的上游调控因子。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物模型制备 雄性Wistar大鼠50只（体重180 g～250 g），由山西医科大学实验动物中心提供。采用改良Pulsinelli四血管夹闭方法进行短暂前脑缺血。大鼠存活6 h、24 h或48 h后进行相关实验。 　　1.2 Caspase-3活性检测 用酶标法测定脑组织裂解物中Caspase-3的活性，蛋白含量标准化校正后的OD 值：以正常组的活性为1，计算其余各组的相对活性。 　　1.3 Western-Blot检测 大鼠在短暂性全脑缺血15 min后再灌注，在缺血再灌注后不同时间点（6 h、24 h、48 h）断头取脑，分离出海马，并迅速在解剖显微镜下将海马CA1区组织分离出来。提取脑组织细胞膜蛋白样品。聚丙烯酰胺凝胶变性电泳（SDS）及蛋白印迹完毕后，抗体按照1∶1 000稀释，β-actin作为内参。经KODAK IS440自显影系统进行曝光显影，使用KODAK MI软件进行吸光度值测定分析。 　　1.4 统计学处理 采用SPSS 13.0 统计软件分析。数据以均数±标准差（x±s）表示，成组设计的多个样本均数比较采用单因素方差分析（ANOVA），检验水准a0.05。 　　2 结 果 　　2.1 大鼠海马CA1区Caspase-3活性检测 与对照组相比，缺血再灌注组Caspase-3酶活性显著升高，随着再灌注时间的延长而逐渐增加，并且在缺血再灌注24 h时达到高峰（P［16,17］。本研究中，NMDA受体中的不同亚基如NR1、NR2A和NR2B的磷酸化水平变化趋势不完全相同，因此推测在脑缺血再灌注发生后，含有NR2A或者NR2B亚基的NMDA受体通过不同功能变化，共同影响了神经元死亡。 　　PKC，作为G蛋白偶联受体信号转导途径中第二信使传递中的重要一环，在脑学习记忆中也具有关键性的作用［13］，其参与了LTP的诱导形成以及突触囊泡的释放。PKC的激活在非洲爪蟾卵细胞上增加了NMDA受体通道的开放，以及促使NMDA受体在细胞膜上表达增多［18］。PKC在丝氨酸890、896位点磷酸化NMDA受体亚基NR1，并且促使了NMDA受体向细胞膜转运［19,20］。在本实验中，PKC的磷酸化水平与NMDA受体NR1、NR2B亚基的磷酸化水平具有时间上的相关性。表明在脑缺血再灌注发生过程中，NMDA受体亚基的磷酸化与PKC有关。CaMⅡ的激活依赖于NMDA受体的激活、胞外钙离子大量内流以及其自身的磷酸化［21］。本研究发现，在缺血再灌注发生过程中，CaMⅡ呈现出与PKC、NR