鞍带石斑鱼精子低温保存分析-analysis of sperm cryopreservation in epinephelus coioides.docxVIP

鞍带石斑鱼精子低温保存研究摘要鞍带石斑鱼(Epinepheluslanceolatus)是我国东南沿海性状优良、经济价值高的名贵海产食用鱼类。然而其雌雄配子成熟不同步，极大限制了大规模种苗的培育，随着近年来配子保存技术的发展，精液的低温储存和超低温冷冻保存技术可以很好地解决这一问题。本文摸索了鞍带石斑鱼精子在4℃低温保存和超低温冷冻保存的适宜条件，伊红Y染色法检测了冷冻保存前后精子质膜的完整性，同时应用试剂盒法检测了冷冻精子中总三磷酸腺苷酶(ATP酶)、乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）等酶活性，从精子结构、生化组成等方面揭示了超低温冷冻保存对精子结构和功能的影响，建立了鞍带石斑鱼精子低温保存方案和超低温保存方案，同时初步阐明了精子冷冻损伤机理。1.鞍带石斑鱼精子4℃低温保存研究（1）分别在改进后的Mounib’s盐溶液（MMM）、Hank’s盐溶液（HBSS）和150mMNaCl3种保存液中低温保存精子。结果表明，精子激活率、快速运动时间和寿命均随着低温保存时间的延长而降低；在所有观察时段里，保存在MMM溶液中的精子其激活率、快速运动时间和寿命均高于保存在HBSS和150mMNaCl溶液中的精子，且在保存96h后，其激活率仍可达60%以上。（2）随着精液与保存液MMM稀释比例从1:1增大到1:100，经24h保存后的精子激活率、快速运动时间和寿命呈现先升高后降低的趋势；而稀释比例增大到1:50时，精子激活率最高，达89.6%；稀释比例为1:20时，精子快速运动时间和寿命达最高，平均分别为21.3min和23.3min。（3）在2ml离心管中分别保存200、500、800、1100和1400μl精子，随着保存体积的增加，精子激活率呈现先上升后降低的趋势，当保存体积为800μl时，精子激活率、快速运动时间和寿命最高，平均分别达89.1%、20.2min和22.3min。2.鞍带石斑鱼精子超低温冷冻保存研究（1）分别用MMM，HBSS和150mMNaCl稀释鞍带石斑鱼精子进行超低温冷冻保存，并于7d后解冻检测其激活率、快速运动时间、寿命、存活率以及总ATP酶、LDH、GSH-PX、总SOD酶活性。结果表明，用MMM溶液稀释保存的精子其各项指标均显著高于HBSS和150mMNaCl稀释保存的精子；而当抗冻剂为15%DMSO时，精子激活率、存活率以及总ATP酶、LDH酶、GSH-PX酶、总SOD酶活性均最高，平均分别为63.3%、69.91%、2.0771umolPi/108个sperm/hour、8660.14U/L、551.84U/L、277.45U/ml，同时精子运动时间和寿命也最长，平均分别为为15.9min和17.4min。（2）随着精液中添加的二甲基亚砜（DMSO）浓度从5%增加至20%，冷冻保存7d后的精子激活率、存活率、总ATP酶、LDH酶、GSH-PX酶、总SOD平均酶活力均呈现先升高后下降的趋势。其中，浓度为15%时，精子激活率和存活率和4种酶活力均达最高，分别为64.3%和68.83%、3.062umolPi/108个sperm/hour、11833.33U/L、602.67U/L和365.28U/ml；快速运动时间和寿命也最长，平均分别为16.1min和18.93min。（3）随着稀释后的精液中添加海藻糖浓度5%增加至20%，超低温保存后的精子激活率和存活率逐渐升高，精子快速运动时间和寿命延长。当浓度为20%时，激活率和存活率最高，平均分别为54.52%和56.97%，快速运动时间和寿命也最长，平均分别为8.5min和17.4min。（4）经MMM和15%DMSO稀释的精液，采取在液氮面上3cm至12cm高度停留5min后投入液氮的两步降温法进行超低温冷冻保存研究。结果表明，冻精解冻后的激活率和存活率随着高度的增加呈先升高后下降的趋势，总ATP酶、LDH酶、GSH-PX酶、总SOD酶活力无显著差异，当高度为6cm时，激活率，快速运动时间、寿命和存活率均达到最高，平均分别为63.91%、16.8min、18.5min和71.72%。（5）精液经不同稀释倍数（2、10、20、50和100倍）稀释后超低温冷冻保存研究。结果表明，当稀释倍数为2、10和20倍时，精子激活率差异不显著；精子稀释10倍冷冻，解冻后获得了最高的激活率，快速运动时间和寿命，平均分别为64.96%，14.2min和16.1min；当稀释倍数从10倍增大到100倍，冻精解冻后的激活率、快速运动时间和寿命逐渐降低。（6）超低温冷冻保存的精子悬液冰上平衡不同时间（5，15，30和60min）后解冻，激活率随着平衡时间的延长而逐步降低，快速运动时间和寿命也随之缩短，；将冰上平衡5min后的精子悬液投入液氮保