靶向沉默蛋白激酶polo-like kinase1治疗骨肉瘤的实验研究-experimental study on targeted silent protein kinase polo - like kinase 1 in the treatment of osteosarcoma.docxVIP

目录前言……………………………………………..1摘要……………………………………………..3关 键 词 … … … … … … … … … … … … … … … … … . . 4A b s t r a c t … … … … … … … … … … … … … … … … … . 5K e y w o r d s … … … … … … … … … … … … … … … … … . . 6正文第一部分 慢病毒短发卡 RNA 库筛选人类激酶组发现蛋白激酶 Polo-like kinase 1 是治疗骨肉瘤的潜在靶点……………………………………………. 7 讨论……………………………………………………………………………………………..23图表……………………………………………………………………………………………..25 第二部分 抑制蛋白激酶 Polo-like kinase 1 表达可阻碍骨肉瘤细胞在体外 和体内的生长………………………………………………………………………………41 讨论……………………………………………………………………………………………..52图表……………………………………………………………………………………………..54 参考文献……………………………………………………………………………………………..74 附录……………………………………………………………………………………………..811 缩略词表……………………………………………………………………………………………..812 攻读学位期间发表论文目录……………………………………………………………..822 攻读学位期间学术交流及奖励情况……………………………………………………..83致谢……………………………………………………………………………………………..84前 言骨肉瘤是一种常见于儿童和青少年的原发性恶性骨肿瘤，其恶性程度高，发展迅 速。骨肉瘤多发生于骨端，偶发于骨骺或骨干。常规治疗方法包括外科手术切除及术 前术后辅助化疗。相比单纯手术治疗，术前术后辅助化疗联合手术治疗可将骨肉瘤患 者生存率由 11%提高到 60-70%。阿霉素，顺铂，甲氨蝶呤和异环磷酰胺是治疗骨肉 瘤最常用的四种药物。尽管如此，一旦骨肉瘤患者对以上四种化疗药物敏感性降低， 可供选择的化疗方案即十分有限。已接受一线化疗药物治疗的晚期骨肉瘤患者常需要 追加多个疗程化疗，因此化疗药物的毒性作用更加明显。即使辅助化疗治疗，1/3 的 骨肉瘤患者还是会发生局部复发或远处转移，一旦发生肿瘤远处转移其生存时间将少 于 1 年。很不幸的，过去 20 年人类在治疗骨肉瘤领域没有取得长足的进步，患者生 存率未得到明显提高。因此，为了提高生存时间，我们需要发现全新的治疗骨肉瘤的 生物靶点。人类激酶组由至少 600 种不同的蛋白激酶组成。蛋白激酶通过磷酸化 250,000 或 更多的位点激活蛋白。蛋白激酶在骨肉瘤病理生理过程中所起的作用还不是十分清 楚。通过研究这些蛋白激酶在骨肉瘤发病过程中所扮演的角色对于发现新的治疗方法 负有重要意义。许多蛋白激酶，例如 IGF-1R, PI3K, AKT, PDGFR 和 mTOR 在不同肉 瘤组织（特别是晚期肿瘤组织）中持续高表达。抑制这些蛋白激酶表达，例如 PI3K, AKT/mTOR, Src, IGF-R, EGFR, JIK 和 JAK 可以抑制肿瘤细胞生长和增殖，将上述蛋 白激酶作为治疗靶点可能开辟治疗各种肉瘤的新方法。许多研究显示骨肉瘤中特定蛋 白激酶表达水平持续增高。发现新的蛋白激酶并证实抑制其表达可诱导骨肉瘤细胞死 亡将极具临床意义。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 Polo 样激酶 1（PLK1）在许多恶性肿瘤中（包括肉瘤） 持续高表达，其在细胞进行有丝分裂和维持基因组稳定性方面有重要作用。大量证据 显示，相比正常人类成骨细胞，蛋白激酶 PLK1 在各种肿瘤，肉瘤细胞系及骨肉瘤肿 瘤组织中表达水平增高，转染合成小干扰 RNA 抑制其表达可以导致各种肿瘤细胞系 发生凋亡。检测从骨肉瘤患者取得的肿瘤组织中蛋白激酶 PLK1 的表达水平，蛋白激酶 PLK1 表达水平高的患者相比表达水平较低的患者生存时间明显缩短。这些研究成果显示抑制蛋白激酶 PLK1 的表达可能是靶向治疗骨肉瘤的新方法。 使用合成小干扰 RNA 沉默肿瘤特定基因使广大研究者能够在细胞水平进行无偏倚的基因功能缺失研究。由于小干扰 RNA 被证实仅能有效地一过性降低哺乳动物特 定基因表达，其在转录水平稳定沉默特定基因的能力存在疑问。最近有研究报