肺表面活性蛋白sp-b定位及模拟肽生物活性初步研究-preliminary study on localization of pulmonary surfactant protein sp - b and biological activity of mimic peptide.docxVIP

中文摘要 中文摘要 摘 要 疏水性肺表面活性蛋白 B（Surfactant protein B,SP-B）是发现最早的肺表面活性 蛋 白， 能够 与肺 泡表 面的 磷脂 相互 作用 形成 稳定 的肺 表面 活性 物质 (puLmonary surfactant,PS)分子层，从而维持肺泡形态和良好的肺顺应性。近年来肺表面活性物质 逐渐成为治疗急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)的重要药物之一。现上市的肺表面活 性物质绝大多数为天然提取物，主要成分为肺表面活性蛋白与磷脂的混合物，SP-B 是其发挥重要作用的成份之一。但由于原料来源的局限、生产的高成本、以及可能会 发生免疫反应和细菌感染等因素限制了其临床的应用。因此，人工合成其关键成份是 近年研究的趋势。 研究目的： 本研究在深入了解大鼠 SP-B 定位以及其序列电荷分布、二级结构和疏水性特点 的基础上，设计和筛选最佳 SP-B 模拟肽结构。人工合成 SP-B 模拟肽，并对合成的 SP-B 模拟肽体外活性、对脂质构象和功能的影响、对大鼠离体肺顺应性的作用等进 行测定，旨在为进一步深入研究开发人工肺表面活性物质奠定基础。 研究方法： ① SP-B 蛋白的定位研究：利用免疫荧光技术检测 SP-B 蛋白在肺组织中定位。利用 基因重组方法构建质粒 pEGFP-N2-SP-B，并通过脂质体转染至 CCL-149 与 A549 细 胞系。 ② 模拟肽的设计、筛选与合成：通过生物信息学工具对模拟肽设计、筛选并采用标 准的 Fmoc 固相化学合成方法合成。 ③ 模拟肽的体外活性初步测定：利用脂质体构建模拟膜，采用 Wilhelmy 式膜天平对 模拟肽体外初步活测定。 ④ 模拟肽与脂质相互作用研究：利用拉曼光谱测定模拟肽对脂质反式与扭曲等构象 信息的变化情况。 ⑤ 体内活性研究：建立大鼠离体肺灌洗模型，肺内滴注模拟肽制剂，测定大鼠离体 肺顺应性。 研究结果： ① 利用免疫荧光确定了 SP-B 蛋白在肺组织中定位。成功构建了 pUC-T-SP-B 与 pEGFP-N2-SP-B 重组质粒，测序结果正确。质粒转染结果显示 SP-B 在 A549 细胞 系中主要定位于细胞质中，而在 CCL-149 细胞系中主要定位于细胞核与细胞膜上， I 重庆理工大 重庆理工大学硕士学位论文 SP-B 有可能为膜蛋白。 ② 通过生物信息学工具设计、筛选出了模拟肽 KAAVV。委托吉尔生化公司合成多 肽，HPLC 结果显示纯度达到 98.6%，质谱分子量结果与理论值一致。 ③ 成功构建脂质体模拟膜，初步体外活性测定显示其能够有效降低气液表面张力。 ④ 拉曼光谱分析结果显示在加入多肽后，使 DPPC 与 DPPG 的 C-C 骨架有序性构象 降低，链间无序性增强。C-H 的伸缩振动表明，加入多肽后增强双层膜的流动性， 显示出了 SP-B 在 PS 中的所起到的作用。 ⑤ 离体静态肺顺应性测定结果显示模拟肽制剂能够明显提高肺顺应性。 关键词：SP-B；定位；磷脂；表面张力；顺应性 II Abs Abstract Abstract Hydrophobic pulmonary surfactant protein B (Surfactant protein B, SP-B) is the earliest discovered lung surfactant protein.As a result of interacting with the phospholipids, they formed a stable pulmonary surfactant (pulmonary surfactant PS) molecular layer in alveolar surface to maintain the morphology of alveolar and good lung compliance. Pulmonary surfactant has became one of the important drug for the treatment of ALI (Acute Lung Injury, ALI) in recent years.Currently, the vast majority of pulmonary surfactant drug listed are natural extracts. The main component of the mixture is lung surfactant protein and phospholipids and SP-B is one of the ingredients of the mixture that played the im