病毒学研究得基本方法.ppt

第三节 病毒学研究的基本方法 内 容 一、理化因素对病毒的作用 二、标本的采集和处理 三、病毒的分离培养 四、病毒的鉴定 五、病毒定量的几个概念 一、理化因素对病毒的作用 理化因素包括热、辐射、pH和化学试剂等对病毒的灭活作用，其作用的的结果是： 改变和破坏病毒核酸，使其失去转录和翻译的功能； 或者是改变和破坏病毒蛋白衣壳或脂质等结构，从而消除病毒的感染性。 但是经灭活的病毒可继续保持其抗原性以及诱导产生干扰素。 了解各种理化因素对病毒的灭活作用，有着重要的实际意义。 由于不同病毒对各种理化因子的敏感性不同，因此在消毒时必须针对该病毒特点，选择最为有效的消毒剂。 相反，在保存毒种或病毒材料时，则必须注意防止和避免各种灭活条件。 病毒对不同理化因素的抵抗力，也是鉴定病毒的一个重要依据。 （一）温度 病毒喜冷怕热。 大多数病毒可在4℃以下良好地生存，特别是在干冰温度(-70℃)和液氮(-196℃)下更可长期保持其感染性。 相反地，大多数病毒可在55～60℃条件下几分钟到十几分钟内灭活，100℃可在几秒钟内灭活。 因此必须低温保存病毒和疫苗等。 各种病毒对热的抵抗力不同，甚至有着明显的差异。例如： 黏病毒和RNA肿瘤病毒等具有包膜的病 毒，感染半衰期为37℃ 1h 而痘病毒在干燥状态下，却可耐受100℃加热5～10min 热对病毒的灭活作用，受周围环境因素的影响。蛋白质以及钙、镁等离子的存在，常可提高某些病毒对热的抵抗力。 长期保存病毒一般采用下述两种方法： 1. 快速低温冷冻 于病毒液中加入灭活的正常动物血清或其他蛋白保护剂，最好再加入5％～10％的二甲基亚砜，并迅速冷冻和保存于-70℃～-196℃。 对含病毒的组织材料可以直接低温冷冻保存，如有些病毒可先浸入50％的甘油缓冲盐水中，再行低温保存，效果更好。 2. 冷冻干燥 在真空条件下使冰冻病毒悬液脱水（通常是冷冻真空干燥），可保存几年甚至几十年，毒力不变。 毒种的保护剂：一般用脱脂牛乳、经灭活的动物血清、饱和蔗糖溶液等。真空干燥时，将病毒液加等量保护剂，每支装0.2～0.5ml，放入冻干机内冷冻。现代冻干机具有冷冻、干燥、抽真空等全部装置，使用十分方便。 （二）pH值 大多数病毒在pH6～8的范围内保持稳定。在pH5.0以下的酸性环境中，以及pH9.0以上的碱性环境中，病毒大多迅速灭活。 酸、碱溶液是病毒学实践中常用的消毒剂。 贮存病毒，以中性或微碱性为宜，例如病毒病料置中性的50％甘油盐水中保存。 但是必须指出，各种病毒对pH变化的稳定性可能显著不同。例如： 呼肠孤病毒能够抵抗pH 3.0； 口蹄疫病毒在pH 6.0～6.5及pH 8.0～9.0迅速灭活； 猪水泡病病毒在pH2.2条件下24h内仍保持其感染性。 因此pH的稳定性，是鉴定某些病毒的一个重要指标。 （三）辐射 电离辐射中的γ射线和X射线以及非电离辐射紫外线，都对病毒呈现灭活作用。其原因是它们可以破坏病毒核酸的分子结构，使其失去生物活性。 （四）超声波和光动力作用 超声波主要以强烈振荡对细菌和其他微生物以及细胞等呈现破坏作用，但对病毒的灭活作用并不明显。常用超声波破坏细胞，使病毒粒子从细胞内释放，以便收获和提纯病毒。 有些病毒核酸被染料（如甲苯胺蓝、啶橙）作用后，就能被可见光灭活，称为染料的光动力作用。 （五）脂溶剂 乙醚、氯仿和丙酮等脂溶剂对有包膜的病毒具有灭活作用。 乙醚等灭活试验是鉴定病毒的一个重要指标。 （六）甘油和抗生素 应用50％的甘油盐水，病毒可以存活数日，甚至几年。生产实践中常用50％甘油盐水保存病毒材料，同时采取冷藏措施，效果较为理想； 一般的抗生素对病毒无作用，故常加入到含有病毒的材料中去，以杀死细菌而有利于病毒的分离与培养。 近年来，人们已发现一些抗生素对病毒有作用，有的已用在病毒病的预防和治疗上，如金刚铵、利福霉素、放线菌素D等。 二、标本的采集和处理 用于分离病毒的标本应含有足够量的活病毒，因此必须根据病毒的生物学特性、病毒感染的特征、流行病学规律以及机体的免疫保护机制，来选择所需要采集标本的种类、确定最适采集时间和标本处理的方法。 标本采集必须无菌操作，如有细菌污染，可通过加抗菌素、过滤和离心等方法处理。 由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经处理后一般应立即接种。 若需要运送或保存，数小时内可置于50％中性甘油内4℃保存，对需较长时间冻存的标本最好置于-20℃以下或干冰保存。 以感染病毒的动物病料采集为例，一般说来，应从病畜体内存在病毒最多的器官或组织采取病料。例如