甘草细胞放大培养的过程工程分析-process engineering analysis of glycyrrhiza uralensis cell amplification culture.docx

AThesisSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofDoctorofScienceStudyonProcessEngineeringofGlycyrrhizainflataCellinLarge-ScaleCulturePh.D.Candidate:LiYaliMajor:BiochemistryandMolecularBiologySupervisor:Prof.YuLongjiangHuazhongUniversityofScienceandTechnologyWuhan，Hubei430074，P.R.ChinaSeptember,2012独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本授权书。不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日摘要甘草是中成药及配方制剂中用量最大的一味药，居国药之首，素有“十方九草”之说。甘草的化学成分复杂，具有多种生物学与药理学活性，广泛应用于食品、保健品、化妆品等行业。近年来野生甘草面临严重的资源问题，而栽培品种周期长、品质低。利用细胞培养技术直接生产植物有效成分是解决野生植物资源短缺有效的方法之一。在实际培养过程中，尚存在很多需要解决的问题，本文以胀果甘草为材料，对甘草细胞大规模培养生产有效成分的可行性、关键问题如甘草细胞悬浮培养体系的优化控制及反应器放大培养等方面开展了较为系统的研究，取得了以下的研究成果：（1）系统分析了胀果甘草悬浮细胞合成的次生代谢产物。利用HPLC指纹图谱结合相似度评价系统，构建了胀果甘草悬浮细胞提取物的指纹图谱，标定指纹峰22个，与野生甘草提取物的指纹图谱相似度为58.4%；并建立了悬浮细胞中黄酮类化合物的指纹图谱，标定指纹峰16个，与野生甘草中黄酮类化合物指纹图谱相似度为75.2%，采用LC-ESI-MS技术初步确定两个主要黄酮类指纹峰分别为甘草苷与甘草素，同时分别采用HPLC和LC-MS/MS技术检测了悬浮细胞中查尔酮A和甘草酸的合成。（2）研究了甘草细胞悬浮体系中酶促褐化反应发生的机理及其有效控制策略。甘草细胞固-液转化后受到液体悬浮环境的渗透胁迫和流体剪切压力，引起细胞膜受伤，导致酚类化合物和多酚氧化酶结合造成酶促褐化的发生。对于甘草细胞来说，比较有潜力的PPO抑制剂是抗坏血酸和L-半胱氨酸，当0.1mM的这两种抑制剂分别被添加到悬浮体系中，褐化现象明显得到控制，细胞活力得到维持。（3）分析了甘草细胞悬浮体系的流变学特性。获得不同发酵时间的流变参数，建立流变本构方程，为甘草细胞放大培养过程的优化操作以及相关的反应器设计和改造提供参考。（4）建立了甘草细胞在搅拌式生物反应器中的放大培养工艺。并对甘草细胞在反应器中悬浮培养的基本特性进行了研究，评价了反应器特有条件下，细胞活力、生物量积累、过氧化氢产量和甘草黄酮合成的变化情况。分别以单因素实验和正交试验所得数据为样本，运用BP神经网络耦合遗传算法获得反应器中细胞生长的最佳操作参数。经实验验证，这种基于神经网络耦合遗传算法的优化方法与传统的正交试验方法相比，反应器中细胞的生物量积累提高了6.9%。（5）建立了根癌由农杆菌介导的胀果甘草悬浮细胞遗传转化体系。并利用该体系，将黄酮类合成途径中的一个关键酶基因-查尔酮异构酶基因，通过构建过表达的pCAMBIA1303-chi重组质粒转化到胀果甘草悬浮细胞中，得到一个稳定的、过表达chi基因，黄酮产量提高的转基因甘草细胞系，甘草黄酮的产量平均提高了0.84倍。关键词：胀果甘草；悬浮细胞；放大培养；过程优化；遗传转化AbstractLicoricehasbeenusedasatraditionalChinesemedicineextensivelyforover2000years.Itisoneofthelargestconsumptionkindsofherbsinformulations.Thechemicalcompositionoflicoriceisveryc