SLE 相关基因 IFIT 免疫调节功能的初步研究.docVIP

　　SLE 相关基因 IFIT1 免疫调节功能的初步研究 【摘要】 目的：研究系统性红斑狼疮（SLE）相关基因 IFIT1 的功能。方法：首先将 IFIT1 从穿梭表达克隆转入真核表达克隆，然后转导进入 Jurkat 细胞系，用有限稀释法筛选单克隆；再用 CD3 和 CD28 刺激单克隆，检测膜分子的表达、细胞凋亡、增生、细胞因子分泌等免疫生物学指标；最后应用 RNAi 技术，下调 IFIT1 的表达，检测细胞因子分泌，比较分析 IFIT1 的功能。结果：IFIT1 的过度表达在 T 细胞中能诱导白细胞介素 IL-4 和 IL-10 的分泌增加，下调 IFIT1 的转录水平后能部分下调 IL-4 和 IL-10 表达，而与细胞膜分子的表达、细胞的增生、凋亡无关。结论：SLE 相关新基因 IFIT1 在细胞因子的产生中起了重要作用，可能与 Thl/Th2 的失衡有关。 【关键词】 系统性红斑狼疮；IFIT1；细胞因子；基因干预 〔Abstract〕Objective To study the function of IFIT1, a novel gene associated ic lupus erythematosus (SLE). MethodsFirst an expression clone of IFIT1 ing an LR recombination reaction bet Genecopoiea and a Gateiting dilution method. The stable transfectants of EGFP and IFIT1-EGFP ulated etry. The apoptosis and expansion of each transfectant anufacture’s instruction. The culture supematants ore transfection of gene silence vector all RNA duplexes partially blocked the expression of overexpressed IFIT1 in Jurkat T cel1. The same assays ulation olecules, apoptosis and expansion among Jurkat, Jurkat/EGFP, and Jurkat/IFIT1-EGFP transfectants. But it ay play an important role in the production of cytokines and may interfere in the Th1/Th2 balance. 〔Key 24594），按照页上的要求设计靶序列特异的 RNAi（选择 IFIT1 的 mRNA 起始编码下游 4 个位点 195、653、1004 及 1241，每个位点长度为 19 个碱基，共 8 条序列），经 Blasr 验证后由深圳匹基公司合成。制备基因沉默的表达质粒按照产品操作说明书进行，经筛选扩增纯化。G418 筛选多克隆，再将 4 种基因沉没质粒分别转染过表达细胞株，用荧光显微镜及定量 PCR 检测 IFIT1-EGFP 的表达，挑选出下调幅度最大的（gt; 70%）沉默质粒进一步扩增。 1.4.2 下调 IFIT1 的 mRNA 后观察细胞因子的分泌水平变化 扩增培养 Jurkat/1FIT1-EGFP 细胞株，每 2 L 沉默质粒转染 2×l06 个细胞，48 h 后，用 CD3（1 g/mL）和 CD28（2 g/mL）刺激细胞株，3 d 后检测细胞因子的分泌水平，同时以空白沉默质粒转染的 Jurkat/IFIT1-EGFP 细胞株为对照。 1.5 统计学处理 所有资料均以均数±标准差（x±s）表示；差异的显著性检验采用 t 检验进行分析；P lt; 0.05 作为显著性界限。2 结果 2.1 IFIT1-EGFP 稳定转染细胞系的建立 电转导 48 h 后，经荧光显微镜观察到约 40% 的细胞表达荧光，经 G418 筛选 4 周后形成几个克隆细胞株，为验证其中 IFIT1 的表达水平，应用荧光定量 PCR 法检测细胞株中 IFIT1 的 mRNA 含量，结果显示 Jurkat/IFIT1-EGFP 细胞株比 Jurkat/EGFP 细胞株明显增高，差异有显著统计学意义（P lt; 0.05）（表 1）。 2.2 细胞膜分子的表达 使用平均荧光强度（MFI）来表示细胞膜分子的表达水平。经流式细胞仪检测，3 个细胞株（Jurkat、Jurkat/EGFP 和 Jurkat/IFIT1-EGFP）之间