T毒素对软骨细胞合成一氧化氮(NO)的影响.docVIP

　　T2毒素对软骨细胞合成一氧化氮(NO)的影响 作者：杨占田，陈静宏，楚雍烈，曹峻岭，王治伦，师钟丽，郭雄 【关键词】; 一氧化氮合酶 ; 　　摘要：目的; 探讨T2毒素对软骨细胞合成一氧化氮(NO)的影响。方法; 胎儿软骨细胞体外培养，用MTT法检测软骨细胞存活率；用Griess重氮化法测定软骨细胞培养上清液中NO含量；用ethods; Human chondrocytes cultured in vitro e (1-5 day). Cell viability of the treated cells easured by MTT assay; The levels of NO in culture media etric method of Griess assay; iNOS protein easured by EM培养基(GIBCO)、胰蛋白酶、透明质酸酶和II型胶原酶(Sigma)、iNOS单克隆抗体(博士德生物工程公司)、四甲基偶氮唑(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、N1萘乙二胺盐酸盐和磺胺(华美生物工程公司)， T2毒素由中国军事医学科学院毒物药物研究所杨进生教授赠送，752型紫外分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)，EI x800型通用酶标仪(基因公司)。 　　1.2; 软骨细胞培养及分组; 中孕引产胎儿的软骨细胞原代培养方法同文献[2]。第一代软骨细胞培养48h后随机分为对照组、T2毒素处理组，将不同质量浓度T2毒素(1、5、10、20、50、100、1000、2000、4000、8000mu;g/L)溶于DMEM完全培养基中(含150mL/L FCS，青霉素100U/mL，链霉素100U/mL)。根据T2毒素对软骨细胞的作用，再选择1、10、20mu;g/L T2毒素处理组作进一步的检测。 　　1.3; 观察指标 　　1.3.1; MTT法检测细胞存活率; 第一代软骨细胞悬液200mu;L(含5times;103的软骨细胞)接种于96孔组织培养板，贴壁生长48h后，加入含不同浓度T2毒素的培养液，每组设6个平行孔，分别培养1-5d，然后加入20mu;L MTT(5g/L)，继续培养4h后，弃去培养液，加入二甲基亚砜150mu;L，用力振荡5min使甲月替结晶溶解完全，最后置于酶标仪490nm处测定A值。细胞存活率用下列公式计算：细胞存活率＝实验组A 对照组Atimes;100% 　　1.3.2; NO浓度测定; 鉴于NO的性质极不稳定，在体内、体外均能很快生成亚硝酸盐和硝酸盐，因此测定样品中的亚硝酸盐和硝酸盐可作为衡量NO合成的指标。本实验采用Griess重氮化法。取细胞培养上清0.5mL, 加入0.5mL Griess试剂(10g/L磺胺和1g/L萘乙二胺盐酸盐等量混合)，混匀室温放置10min，于紫外分光光度计540nm处测定A值，以亚硝酸钠为标准，计算NO浓度。 　　1.3.3; iNOS的检测; 采用n;标准差(plusmn;s)表示，采用SPSS 10.0软件包统计分析，各组间比较采用方差分析，Plt;0.05为差异有显著性。 　　2; 结 ; 果 　　2.1; T2毒素对软骨细胞存活率的影响; 随着T2毒素质量浓度的增加，细胞存活率明显下降，细胞生长抑制也越来越明显，呈浓度依赖关系；随着作用时间的延长，T2 毒素对软骨细胞的抑制作用也逐渐加强，呈时间依赖关系。各组T2毒素作用于软骨细胞5d时抑制作用已达到近饱和(图1)。图1; 不同浓度T2毒素在不同作用时间对软骨细胞存活率的影响（略） 　　2.2; T2毒素对软骨细胞NO浓度的影响; 不同质量浓度的T2毒素均能明显增加培养上清液中NO的浓度(Plt;0.05)，并呈浓度依赖关系(表1)。表1; 不同质量浓度T2毒素在不同作用时间对软骨细胞合成NO的影响（略） 　　2.3; T2毒素对软骨细胞表达iNOS蛋白的影响; T2毒素能增强iNOS表达 (Plt;0.05)，在实验所选范围内，浓度越高，iNOS表达越强，刺激作用越明显(图2和表2)。 ; 图2; T2毒素诱导软骨细胞表达iNOS蛋白的Western blotting 电泳结果（略） ; 表2; T2毒素诱导软骨细胞表达iNOS蛋白的积分吸光度值（略） 3; 讨 ; 论 　　镰刀菌广泛存在于自然界中。T2毒素是由镰刀菌产生的单端孢烯族毒素(Ts)中最毒的一种，是食物中常见的污染性霉菌毒素。国内外研究表明，饮食中污染T2毒素可以对机体造成多种病理损害，如血液毒性、免疫毒性以及对软骨的损伤等。本研究用MTT法检测了T2毒素对软骨细胞的损伤和生长抑制作用，发现软骨细胞经不同质量浓度T2毒素作用后，