遗传学课件12第十二篇 章（遗传工程）.pptVIP

3、克隆大片段DNA的载体 黏粒载体、细菌人工染色体和酵母人工染色体载体 。 图12-11黏粒载体pJB8图谱 黏粒载体（cosmid）柯斯质粒 噬菌体DNA包装成功噬菌体时所必需的。 质粒的复制原点 可以接受15~45kb的外源DNA 细菌人工染色体（BAC） 可以克隆300kb左右片段 酵母人工染色体（YAC） YAC载体可以插入大片段的DNA（1-2Mb） 三、基因的分离 （一）从基因文库中分离基因 基因文库：是由单一来源的特定组织或器官的DNA或cDNA片段汇总形成的克隆群体。 1、基因库的构建 基因组文库：全部基因组DNA酶切后与载体连接构建而成的一个重组DNA群体 。 cDNA文库：是以mRNA为模板，在反转录酶的作用下，合成互补DNA（cDNA），将获得的双链cDNA与适当载体连接并转化到宿主细胞内进行扩增，而构建成的基因库。 cDNA文库与基因组文库的不同 基因组文库代表了基因组中的所有基因，而cDNA文库仅代表某一特定细胞类型，某一组织，或某一胚胎发育时期的表达序列。 2．从基因库中分离特定的克隆序列(基因) （1） DNA探针 探针是待筛选的目的基因或克隆的一段互补的核酸序列。利用DNA探针可以从基因库中筛选特定的克隆 通常探针用同位素标记，但也可使用荧光标记或颜色反应标记探针。探针可以有多种来源，如果筛选植物基因，探针可以来源于植物本身，也可以来源于异源植物、动物中的同类基因的保守序列。 (2) 筛选文库 （3）阳性克隆的分析与鉴定 从文库中筛选获得目标克隆后，只有进行测序才能进行生物信息分析和功能预测。，确定测定的核酸序列是不是所需要的基因，采用适当的软件预测它具有什么功能。 （二）T-DNA标签克隆基因 T-DNA 载体构建 转化植物（T1，T-DNA杂合子)收获T2种子 筛选T2，获突变子，应为3:1分离 确定T-DNA与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆T-DNA两侧的植物DNA（Plasmid rescue; IPCR; Tail PCR) 利用侧翼DNA序列作探针从该植物的cDNA文库中钓取基因 基因功能的验证 （三）PCR扩增基因 （四）人工合成基因 第三节 外源基因的导入 一、重组DNA导入原核生物 1．CaCl2处理转化： 将细菌细胞用冰上预冷的CaCl2处理，然后转移到42℃的条件下处理90秒。CaCl2处理转化的机制尚不清楚，可能是CaCl2处理破坏了细菌的细胞壁，使游离的DNA分子被摄入受体细胞。转化频率大概是千分之一。 2．电激转化（electroporation） 是目前常用的一种转化方式。在电转化仪施加的强电场的作用下，使受体细胞细胞壁具有可逆的电穿孔，以使DNA分子进入细胞。进行电转化操作时，细菌细胞和DNA分子放在带有电极的小室中，通过小室（chamber）施加电脉冲，使细胞壁穿孔，然后DNA分子进入细胞。电转化的频率通常是10-6~10-9，因质粒的大小而异。 3．结合（conjugation）结合是原核生物细胞与细胞接触而进行遗传物质转移的一种自然过程。 二、植物表达载体 作为植物基因转化的载体，必须具有两种功能： （1）能作为媒介将外源基因导入到植物细胞中去，并且整合到宿主细胞的基因组DNA上； （2）能提供被寄主细胞的复制和转录系统所识别的DNA序列，即启动子和复制子起始位点，以保证转化的外源基因能在植物细胞中进行复制和表达。 Ti质粒 Ti质粒是根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）染色体外的遗传物质，为双股共价闭合的环状DNA分子，约有150~200kb。 各种不同类型的Ti质粒都具有T-DNA区、毒性区、质粒复制起点、质粒结合转移位点和冠瘿碱分解位点(图12-13)。其中以T-DNA区和毒性区在植物转化中最为重要。 T-DNA两端各有一段25bp的重复序列（分别称为左边界序列和右边界序列）。 T-DNA携带的致瘤基因实际上就是一些与激素合成有关的基因，称为致瘤基因，T-DNA的右端序列对T-DNA转移到植物细胞内具有重要意义。保留T-DNA两端的末端序列，然后用一段外源DNA插入或直接取代野生型T-DNA的部分基因可以使植物细胞的致瘤基因除去，从而导致转化的植物细胞不具有成瘤能力。 T-DNA(转移DNA): 是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上导入植物细胞的一段DNA。 Vir区段总长度大约35kb，由7个互补群组成，分别命名为VirA、VirB、VirC、VirD、VirE、VirG和VirH。毒性区中各个位点的表达情况可以分为两种：一种是组成型表达，即在无植物诱导分子存在下依然保持一定的表达水平；另一种是植物诱导型表达，即这些基因的表达必须在土壤农杆菌感染植物受伤组织时，植物细胞分泌的信号分