液相微萃取在中药齐墩果酸和熊果酸研究及其与蛋白结合的应用分析-study on the application of liquid phase microextraction in oleanolic acid and ursolic acid and its combination with protein.docxVIP

前言中药药物的化学成分复杂、各成分的含量不稳定、分析过程中干扰因素多 且有效物质基础不明确等特点给中药药物分析研究者提出了巨大挑战。但因其 副作用小、治病治本和经济实惠等独特优势，越来越多的人们开始关注它的发 展。因此，选择合适的中药检测手段，制定合理的中药质量标准意义重大。目 前的中药样品前处理技术远不能满足和适应先进的分析测定技术，制约着中药 分析现代化的发展。齐墩果酸(oleanolic acid, OA)和熊果酸(ursolic acid, UA)（结构见图1）是同分 异构体的三萜酸，仅一个甲基位置不同，难以分离。它们在植物界中广泛存在 而且总是同时存在于同种植物。加之药理作用多样，吸引众多研究者的目光。 已报道的分离测定植物中OA和UA的方法很多，如胶束电动毛细管色谱，毛细管 区带电泳，直接高效液相色谱-紫外检测和高效液相色谱光电二极管阵列检测， 柱前衍生化高效液相色谱和碘衍生化高效薄层色谱法等。药物血浆蛋白结合（drug-protein binding，DPB）指药物小分子与血浆蛋白 大分子间的可逆性相互作用，是影响药物药动学和药效学的一个重要体内过程。 药物与血浆蛋白的结合能确保药物通过血液运送到全身活性部位，但过高的结 合不利于药物达到治疗水平，反而引起若干副作用。因此，测定游离药物浓度 和表征药物蛋白相互作用在药物开发和临床治疗药物监测中意义重大。过去几 年来，用于测定 DPB 的分析方法有平衡透析结合液质联用法，超滤法，毛细管 亲和电泳法，高效亲和色谱法，柱前衍生化反相高效液相色谱法，固相萃取结 合液质联用和核磁共振波谱法等。然而，这些方法有一些缺点，或者耗时，或 者与膜有非特异结合，或者难以自动化，灵敏度低，精密度差，或者衍生化反 应条件苛刻等。液相微萃取技术，因其有机溶剂用量少、环境污染小、方便与各种分析仪 器联用、易于实现自动化等特点，近年来发展迅猛，萃取模式多样。在环境、 生物、药物、食品等复杂基质的样品分析，医学及法医鉴定等领域中发挥出优异的应用效果。这种有极大应用潜力的样品前处理技术正在被应用于研究药物与生物大分子间的相互作用，且有不少工作被报导。 本文主要研究了以下内容：（1）分散液相微萃取（dispersive liquid-liquidmicroextraction, DLLME）和中空纤维溶剂棒微萃取（hollow fiber solvent bar microextraction, HFSBME）两种萃取模式结合高效液相色谱法用于中草药中OA 和UA的浓缩和含量测定，与2010年中国药典方法的测定结果比较，得出合理的 结论；并与已报道的相关方法进行比较。（2）计算了两种模式下两种三萜酸化 合物的富集倍数，并对 HFSBME 模式萃取后分析物的富集倍数和萃取效率及 其关系进行定义和推导，对HFSBME的方法原理进行简要探讨。（3）利用 HFSBME 结合 HPLC对两种三萜酸化合物与牛血清白蛋白（BSA）、人血清白 蛋白（HSA）相互作用进行了研究，并计算相应的结合参数；考察了两种三萜 酸共存和单独存在时对蛋白结合的影响以及DPB的浓度依赖性。（4）利用 HFSBME 结合 HPLC对两种三萜酸化合物与结直肠癌细胞HCT116相互作用进 行了试探性研究，并进行了阳性对照实验，进一步佐证该方法应用于药物与细 胞作用初步研究的可行性。研究证明液相微萃取技术是一种快速、简单、可靠、有效的样品前处理技 术。该技术不仅在中药复杂样品中痕量成分的提取、分离和浓缩中起重大作用， 而且为研究药物与生物大分子间相互作用提供了途径。HCOOHHCOOHHHHOHOAB图1 齐墩果酸（A）和熊果酸（B）的结构Fig. 1 Chemical structures of oleanolic acid (A) and ursolic acid (B)第一部分液相微萃取技术 在中药齐墩果酸和熊果酸分析中的应用Ⅰ分散液相微萃取结合高效液相色谱法 同时测定中草药中齐墩果酸和熊果酸的含量摘要同分异构体的三萜酸化合物齐墩果酸（oleanolic acid, OA）和熊果酸（ursolic acid, UA）具有非常低的紫外吸收，且通常同时存在于同种植物中，二 者 的 同 时 分 离 和 测 定 不易 。 目的 ： 本 文 利 用 分 散 液 相 微 萃 取 （ dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME）结合高效液相色谱法同时萃取和测定中草 药枇杷叶和白花蛇舌草中 OA 和 UA 的含量，为复杂样品中药有效成分的分离、 纯化和浓缩提供一个简便、环境友好的前处理方法。方法：考察了萃取剂种类 与体积、分散剂体积、供相 pH、离子强度、萃取时间、供相体积、离心转速和 时间