sigma-1受体在非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义-expression and significance of sigma - 1 receptor in nonalcoholic fatty liver disease.docxVIP

第三军医大学硕士学位论文 第三军医大学硕士学位论文 PAGE PAGE 6 Sigma-1 受体在非酒精性脂肪性肝病中的表达及意义 摘 要 非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除外病毒、药物、酒精等因素，主要由代谢因 素引起的一系列疾病谱，包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎及其相关 性肝纤维化、肝硬化，甚至相关性肝癌。“二次打击”学说是目前最广为接受的关于 NAFLD 的发病机制学说。第一次打击是指胰岛素抵抗并导致大量的脂质如甘油三酯 在胞浆内的堆积，第二次打击则主要指氧化应激。最近的研究提示内质网应激可能在 NAFLD 中起到了重要的作用。我们之前在体实验也证实了内质网应激可促使非酒精 性单纯性脂肪肝(NAFL)向非酒精性脂肪性肝炎(NASH)转化。但是肝细胞内脂质的增 多是如何激发内质网应激的并不清楚。也就是说，找到脂毒性启动 ERS 的方式具有重 要意义。 内质网是具有脂质合成、蛋白质翻译合成以及钙离子贮存等功能，是胞内重要的 细胞器。细胞脂肪变发生时，脂滴首先在内质网内合成，然后以“出芽”的方式进入 胞浆内。主要表达于内质网膜上的 Sigma-1 受体(Sigma-1R)参与了内质网脂滴出芽的 过程。有研究通过外界干扰的手段，发现 Sigma-1R 的静默表达可导致脂质堆积在内 质网中，造成内质网内环境紊乱并发生进行性病变。这些线索提示：在 NAFLD 发生 发展过程中，Sigma-1R 可能是细胞内脂质堆积潜在的打击靶点，但目前尚无 Sigma-1R 与 NAFLD 之间关系的研究。因此，本研究目的在于明确 NAFLD 中 Sigma-1R 的表达 变化及初步探讨其意义。 方法： 1. 通过在培养基中加入软酯酸钠建立了肝细胞脂肪变的体外模型。 2. 应用含 10%胎牛血清的 DMEM 培养基培养 HepG2 细胞，当细胞汇合度达到 80%以上，所有培养皿中的细胞进行胎牛血清剥夺过夜。然后将对照组(0h 组)用 DMEM 加 1%不含脂肪酸的牛血清白蛋白培养。模型组用 DMEM 加 1%不含脂肪酸的牛血清 白蛋白加 500μM(微摩尔/升)的软脂酸钠进行培养。根据诱导脂肪变的时间，模型组分 * 本课题由国家自然基金资助 为 2h 组、4h 组、8h 组和 12h 组。 3. 尼罗红染色显示胞内脂滴，利用激光共聚焦显微镜观察细胞脂肪变程度。 利用 Real-time PCR 检测葡萄糖调节蛋白 78(GRP78)及 Sigma-1 受体(Sigma-1R) 的 mRNA 水平的表达。 利用 western-blot 检测 GRP78 和 Sigma-1R 在蛋白水平上的表达变化。 6. 利用 MTT 法检测各组细胞在脂肪变诱导后的细胞活性。 7. 利用 SPSS 软件，对 Sigma-1R 蛋白水平与 GRP78 蛋白水平、Sigma-1R 蛋白水 平与细胞活性以及 GRP78 蛋白水平与细胞活性进行相关性分析。 结果： 1. 尼罗红染色评价脂肪变程度 在 500μM 软脂酸钠的作用下，HepG2 细胞被成功地诱导发生了脂肪变。尼罗红 染色后脂滴在胞浆内呈现为红色的原点。利用 IPP6.0 软件进行图像分析处理，发现每 个细胞的平均脂变面积随诱导时间延长而增加。12h 组的平均脂变面积达到 435.14± 39.87 像素，明显高于正常对照组(P0.01)。 Real-time PCR 检测 GRP78 和 Sigma-1R 的 mRNA 水平表达情况 GRP78 的 mRNA 水平在 8h 组和 12h 组高于 0h 组(P0.05)。Sigma-1R 的 mRNA 水平从脂肪变诱导 2 小时后即开始出现下降，即是说 2h 组细胞的 Sigma-1R 在 mRNA 水平上较 0h 组明显下调(P0.05)。 Western blot 检测 GRP78 和 Sigma-1R 的蛋白表达水平 8h 组和 12h 组的 GRP78 蛋白表达水平较 0h 组明显升高(P0.05)，与其 mRNA 水 平表达趋势一致。然而，Sigma-1R 的蛋白水平在诱导 8 小时后才出现，晚于其 mRNA 水平的下降。8h 组和 12h 组的 Sigma-1R 蛋白水平较 0h 组明显下降，差异具有统计学 意义(P0.05)。 4. MTT 检测细胞活性 MTT 检测提示细胞活性在细胞脂肪变性加重过程中逐渐下降，12h 组细胞活性率 在 59.86±4.47%，较 0h 组明显降低(P0.05)。 5. 相关性分析结果 相关性分析结果提示 Sigma-1R 蛋白水平与 GRP78 蛋白水平呈负相关(r= -0.932， P0.01)，Sigma-1R 蛋白水平与细胞活性呈正相关(r=0.