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GSNH抗生育机理研究 　　【摘 要】 通过研究棉酚衍生物―牛磺酸棉酚（GSNH）对大鼠精子乳酸脱氢酶的作用机理发现，随着大鼠服药量的累加，作为精子活动能源的主要酶系之一，乳酸脱氢酶（LDH）的X-同工酶（LDH-X）逐渐减弱至消失，GSNH通过竞争抑制精子线粒体特异性酶―LDH-X，使精子的浓度能量来源被彻底阻断，从而产生了抗生育作用。 　　【关键词】 棉酚衍生物; 乳酸脱氢酶; 机理; 抗生育 　　 　　棉酚（Gossypol）是我国首创的男性避孕药，对棉酚的研究和临床观察中发现，长期使用棉酚具有一定的毒副作用[1]。为达到既保持棉酚抗生育性能，又降低棉酚毒副作用的目的，我们进行了棉酚的分子结构改造[2-4]，合成了棉酚衍生物GSNH，并对它的抗生育机理进行了研究。研究发现GSNH作用机理与棉酚相似，GSNH通过竞争抑制精子线粒体特异性酶―LDH-X，使精子的能量来源被彻底阻断，从而发生了抗生育作用。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1．1主要材料、试剂与大型仪器 　　（1）GSNH，由吉林省人口生命科学技术研究院实验室提供。（2）棉酚、醋酸棉酚(山东中医药大学提供)和GSNH溶液配制：先分别以1%羧甲基纤维素（CMC）助溶，再以蒸馏水稀释，配制成所需要的浓度。（3）Wistar大鼠，由吉林大学动物室提供，平均体重230g。（4）所用各种酶及显色物质等生化试剂均为Sigma产品；普通试剂为分析纯以上。（5）紫外分光光度计，日本岛津UV-260。（6）超声细胞粉碎仪，美国Soniprep150。（7）低温高速离心机，美国Beckman J?2-MC。（8）电泳仪。 　　1．2实验方法 　　1．2.1动物分组、剂量及给药方法健康成熟雄性大鼠，平均体重230g；40只大鼠分成四组， 10只/组。分别为阳性对照组、样品高剂量组、样品低剂量组、阴性对照组。阳性对照组给醋酸棉酚30mg/（kg#8226;d）；阴性对照组给服同样量的0.5%的CMC；样品高剂量组给服GSNH 30mg/（kg．d）；样品低剂量组给服GSNH 15mg/(kg#8226;d)。自制胃管灌喂实验动物6次/周，连续56天。 　　1．2.2提取将大鼠解剖，取睾丸及附睾，首先去除睾丸周围的脂肪、剥除被膜、称重、分离得到精子，即睾丸组织按1：6加入蔗糖-Tirs-DETA缓冲液（0.2M蔗糖、5mMTris、1mMEDTA、PH 7.5）???剪碎组织，1700g离心5min，上清则为精子溶液，再3000g离心10min，沉淀加去离子水在-30℃冰箱中放置2h，室温结冻后，在水浴中超声匀浆30sec，共3次，1000g离心10min后，取上清为精子匀浆液做电泳分离。 　　1．2.3电泳条件及实验方法聚丙烯酰胺盘状电泳分离同功酶，加以下显色液作用显示LDH同功酶：①1M乳酸钠；②硝基四氮唑兰（NBT）1mg/ml；③磷酸缓冲液0.5M PH 7.5；④辅酶I（NAD+）10mg/ml；⑤吩嗪甲酯硫酸盐（PMS）2mg/ml；⑥5mM MgCl?2溶液。按3∶7.5∶7.5∶3∶0.75∶3比例混合，在37℃暗处保温45~120min，至同功酶区带清晰可见，取出胶柱，用水洗去显色液，7.5%醋酸终止酶促反应，观察结果。 　　 　　2结果 　　 　　结果发现，大鼠精子的乳酸脱氢酶同功酶电泳中，阴性对照组精子匀浆经电泳分离显色后可分成6条紫色的区带，泳动最快的是LDH-1，最慢的是LDH-5，在LDH-3、LDH-4之间出现反应最强和区带最宽的是LDH-X。 　　服GSNH后，电泳分离、显色观察可见，LDH-1至 LDH-5的区带强度、宽度变化不大，而LDH-X区带明显减弱至消失，服用GSNH的剂量对LDH-X区带宽度和强度有影响，高剂量组变化比低剂量组变化大，作为阳性对照组的棉酚也出现同样的结果。 　　 　　3讨论 　　 　　LDH-X为精子的特异性酶，它占精子LDH总量的40%~50%，在男性生殖生理中具有重要的意义。它只存在于生精细胞的精母细胞和精子细胞的成熟精子中，支持细胞和间质细胞内没有LDH-X，它定位于精子的线粒体中，为精子活动能源的主要酶系之一，有关棉酚对人、大小鼠、猪和牛等动物睾丸的LDH-X有抑制作用的研究，早就有过报道，同时有研究表明精子和精浆中，LDH-X活性与男性不育有密切关系。从本实验的结果看， GSNH与棉酚对大鼠精子LDH-X的抑制作用基本一致，随着服用药量的累加，LDH-X逐渐减弱至消失，可能由于GSNH对线粒体造成的损伤，导致了酶活性的改变。可见，GSNH对LDH-X活性的影响可作为检验精子受损的指标，说明经过分子改造后的GSNH，没有造成棉酚抗生育作用位点及机理的改变。 　　服GSNH