HPV16新型伪病毒对DNA特异性B细胞靶向实验研究.docVIP

HPV16新型伪病毒对DNA特异性B细胞靶向实验研究 　　【摘要】目的：构建人乳头状病毒( human papilloma virus，HPV) 16型的新型伪病毒，并检测其对DNA特异性B细胞（R4A）的靶向性。方法：利用昆虫杆状病毒表达系统表达病毒蛋白，在体外变性与复性过程中将病毒蛋白包装绿色荧蛋白EGFP表达型质粒，形成伪病毒。透射电镜观察病毒样颗粒( virus-like particle， VLP)的结构，并转染R4A细胞，荧光显微镜和流式细胞仪检测其转染效率。结果：透射电镜观察证实病毒蛋白可自我组装成VLP，在转染R4A细胞后，荧光显微镜和流式细胞仪成功检测到荧光的表达。结论：HPV16的新型伪病毒能成功转染R4A细胞，为系统性红斑狼疮（SLE）的靶向治疗提供了理想的策略。 　　【关键词】人乳头状瘤病毒16型；伪病毒；靶向性 　　文章编号：1009-5519（2008）11-1581-02 中图分类号：R37 文献标识码：A 　　 　　系统性红斑狼疮（SLE）主要是由多克隆自身反应性B细胞介导的自身免疫性疾病，其直接的致病因子是多克隆自身抗体，并以免疫复合物的形式造成多种组织器官损伤。抗双链DNA抗体不仅具有诊断学价值，而且是触发SLE的主要致病性抗体[1，2]。作为抗双链DNA抗体来源的DNA特异性B细胞，在SLE发病中扮演关键角色[3]。目前临床上主要使用糖皮质激素及其它广谱免疫抑制剂防治SLE，但是不良反应明显，效果有限。因此寻求新的治疗手段成为临床上的迫切需求，以DNA特异性B细胞为靶标的干预治疗策略现已成为学者们探索的热点[4，5]。 　　最新研究表明人类乳头状病毒16型（Human Papillomavirus type-16，HPV16）的主要衣壳蛋白（L1）具有自身装配成病毒样颗粒（Virus-like Particles，VLP）的特性，HPV16 L1还能将外源DNA分子包装成伪病毒，具有高效的细胞转染活性[6]。另外Gaynor等[7]以抗ds-DNA抗体为亲和配基，从噬菌体随机肽库中筛选得到了多个表位肽，可模拟DNA分子与抗ds-DNA抗体结合。其中一个序列为DWEYSVWLSN的10肽（我们命名为PD肽），与ds-DNA抗体有高亲和力。因此PD肽在理论上可用来引导融合蛋白或基因载体对DNA特异性B细胞进行杀伤或干预。根据以上发现，我们选择绿色荧光蛋白EGFP表达型质粒与包含PD肽的病毒蛋白HPV16 L1包装成新型伪病毒。研究用透射电镜观察病毒样颗粒的结构，并转染R4A细胞，荧光显微镜和流式细胞仪检测其转染效率。我们希望该伪病毒能具有很好的靶向活性，为SLE的高效治疗提供理论依据。 　　 　　1 材料与方法 　　 　　1.1 材料 　　1.1.1 细胞株：dsDNA特异性B细胞杂交瘤细胞（R4A）由美国Putterman教授惠赠，小鼠骨髓瘤细胞 (SP2/0)，小鼠T淋巴瘤细胞（EL-4）由本研究所保存。 　　1.1.2 质粒、菌株和衣壳蛋白：绿色荧光蛋白EGFP表达型质粒为本研究所保存。HPV16 L1委托上海生工表达并纯化。 　　1.1.3 主要试剂：细胞培养基RPMI1640购自GIBCO公司，小牛血清购自华美公司。 　　1.1.4 主要仪器：流式细胞仪，FACS Calibur型， BD公司。荧光显微镜NikonTE-2000。 　　 　　1.2 方法 　　1.2.1 伪病毒的构建：将纯化的HPV16 L1 1 mg于1 ml的PBS中溶解。溶解后的蛋白溶液在终浓度为5%的2-巯基乙醇中变性，4 ℃，16 h。在变性的蛋白溶液中加入2 mg的表达质粒。并将变性蛋白与质粒的混合物放于透析带中，在PBS溶液中于4 ℃透析过夜，使变性蛋白逐渐复性。 　　1.2.2 透射电镜观察实验：将新鲜制备的疫苗滴于200目铜网上，吸附3 min。吸水纸吸干，晾干 30 s。以1%质量体积分数的水溶性醋酸铀负染30 s，吸水纸吸干， 晾干30 s。80 kV透射电镜观察。 　　1.2.3 细胞转染实验：6孔板中用含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养R4A、SP2/0、EL-4，培养至融合率为50%时，加入伪病毒15μl，继续培养48 h。 　　1.2.4 细胞转染检测实验：转染的各组细胞于荧光显微镜下观察荧光情况，并用流式细胞仪检测转染效率。 　　 　　2 结果 　　 　　2.1 透射电镜观察结果：L1具有自我组装成颗粒样结构的特性。在变性剂2-巯基乙醇的作用下，L1解离成细小的分子结构，并在PBS溶液中能逐渐复性，恢复成为原来的颗粒样结构。在该过程中，L1能充分包装质粒分子，形成模拟病毒样结构的伪病毒，见图1。 　　 　　2.2 荧光显