ISLC1基因甲基化与宫颈癌HeLa细胞凋亡相关性研究.docVIP

ISLC1基因甲基化与宫颈癌HeLa细胞凋亡相关性研究 　　【中图分类号】 R234 【文献标识码】 A 【文章编号】1185-1672(2007)-04-0294-03 　　摘要 目的 研究天花粉蛋白诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中肿瘤抑制基因TSLC1的甲基化的变化情况，并探讨其在宫颈癌的发生发展中的作用及细胞凋亡和抑癌基因甲基化的相关性，寻找新型的去甲基化药物。方法 应用MTT法检测对HeLa细胞增殖抑制的影响；流式细胞仪分析天花粉蛋白对宫颈癌HeLa细胞诱导凋亡作用；甲基化特异性PCR技术（MSP）检测天花粉蛋白处理前后宫颈癌HeLa细胞中TSLC1基因启动子区CPG岛的甲基化的变化情况。结果 宫颈癌HeLa细胞中TSLC1基因启动子区CPG岛是呈高度的甲基化状态，经天花粉蛋白处理后，HeLa细胞生长明显受抑，流式细胞仪分析出有特征性的亚二倍体凋亡峰，TSLC1基因启动子区CPG岛无异常甲基化表现。结论 天花粉蛋白诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡过程中对TSLC1基因有明显的去甲基化作用，可能是新型的甲基化抑制剂，肿瘤细胞凋亡与抑癌基因的甲基化失活之间可能存在某些相关性。并且TSLC1基因甲基化的检测有可能成为宫颈癌的早期诊断和指导临床治疗的又一指标。 　　关键词 TSLC1基因；宫颈癌；CPG岛；甲基化 　　在肿瘤的发生发展中研究新基因的变化及其引起的生物学特征改变，对于阐明补充其发病机制，指导临床治疗具有重大意义。宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。虽然人乳头瘤病毒(human papilloma virus, HPV)感染是宫颈癌发生的必要条件，但HPV感染者并不全都进展为宫颈癌，宿主因素如致癌基因激活、抑癌基因(tumor suppressor gene, TSG)失活等，同样影响着宫颈癌的发生和发展。有文献报道［1］，在宫颈癌组织中TSLC1基因呈高度的甲基化状态，但是其确切的分子机理尚未阐明，故而对该恶性肿瘤进行发病机理方面的深入研究具有重要意义。基因的表遗传学修饰被认为是肿瘤发生的第三种机制［2］?。DNA的甲基化导致肿瘤抑制基因失活，从而促进肿瘤的发生和发展［3］。TSLC1基因是近年来新发现的肿瘤抑制基因，能抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，在非小细胞肺癌、胰腺癌、胃癌、鼻咽癌等多种肿瘤中均有TSLC1基因的失活，但在宫颈癌中的作用鲜见报道。本文???用天花粉蛋白(Trichosanthin,TCS)诱导HeLa细胞凋亡，并应用甲基化特异性PCR技术（MSP）技术检测HeLa细胞凋亡过程中TSLC1 基因启动子区5‘CpG岛的甲基化状况，以探讨TSLC1基因甲基化与HeLa细胞凋亡之间的相关性，寻求新的去甲基化药物。 　　 　　1 材料和方法 　　1.1 主要试剂 RPMI-1640培养基和胎牛血清（FBS）购自美国GIBICO公司，噻唑蓝（MTT）购自AMRESCO公司，EZ-DNA甲基化试剂盒购自ZYMO公司，QIAGEN基因组DNA抽提试剂盒购自QIAamp DNA minikit,天花粉蛋白（TCS）购自上海金山制药有限公司，Taq-Hotstart DNA聚合酶购自兴华基因公司，引物由上海生工合成。 　　1.2 细胞培养 人宫颈癌HeLa细胞株由三峡大学分子生物研究所提供，培养于5%CO?2，37。C湿化孵箱中，RPMI-1640培养基含体积分数10%FBS，100U/ml青霉素，100U/ml链霉素。 　　1.3 TCS对HeLa细胞增殖抑制作用的影响 采用MTT法进行检测：常规胰酶消化，收集细胞，接种于96孔细胞培养板内（每孔103-104个细胞），待细胞贴壁后，对照组换新鲜RPMI-1640培养液，实验组换用含有不同浓度的TCS（20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml）的培养液，每个浓度做4个复孔，置于CO?2培养箱内分别培养24h,48h,72h,弃尽孔内培养液，加入2mg/ml的MTT每孔200μl，继续培养4h，终止培养，然后弃尽孔内培养液，每孔再加入200μl的DMSO，振荡30分钟。测定570nm波长处的光吸收值（A570）。取4孔的吸收值平均数，按公式计算药物对细胞的抑制率。细胞抑制率（%）=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值）×100%。 　　1.4 流式细胞仪分析细胞周期和凋亡率 根据MTT的检测结果，收集不同浓度的TCS（20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml）作用48h后的HeLa细胞，PBS清洗两次，离心，弃上清，然后加入75%预冷的乙醇固定18小时，再弃上清，加RNase消化30分钟，离心后加入PI染料避光染色20分钟，以300目尼龙膜滤过，上流式细胞仪检测，Multicycles软件分析结果。 　　1.5 MSP法检测天花粉蛋