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WT1基因在急性髓系白血病中作用研究 　　摘要：目的：量化研究WT1基因在急性髓系白血病中的作用。方法：用实时定量RT-PCR方法检测急性髓系白血病患者化疗前后骨髓单个核细胞WT1 mRNA表达量。结果：40例急性髓系白血病患者中，33例化疗前WT1 mRNA值增高，阳性率为82.5%，化疗后完全缓解者27例WT1 mRNA 值转阴或明显下降，部分缓解者WT1 mRNA值下降，无效者WT1 mRNA值变化不明显。长期持续缓解者，WT1 mRNA值阴性或稳定在较低水平，复发患者1~2月前WT1 mRNA再次升高。结论：WT1 mRNA表达量的测定对急性髓系白血病微小残留病检测具有重要意义。可以作为急性髓系白血病疗效评估和监测急性髓系白血病微小残留的指标。 　　关键词：急性髓系白血病；WT1基因； 逆转录聚合酶链反应；微小残留病 　　 【中图分类号】R557【文献标识码】A【文章编号】1672-3783(2012)03-0025-02 　　 WT1基因，也就是Wilms肿瘤基因，最早在儿童遗传性肾母细胞瘤瘤细胞的11号染色体短臂1区3带中检测出来。近年来，在各种类型白血病包括急性和慢性白血病都检测出WT1基因高表达。为进一步了解WT1基因与急性髓系白血病的关系，我们采用了实时定量-PCR方法在化疗前、后检测40例WT1mRNA基因量的变化。 　　1 对象 　　选取2009年1月至2011年6月在我院就诊患者，其中40例急性髓系白血病，男28例，女12例，中位年龄39岁。按MICM分型M02例，M15例，M214例，M310例，M43例，M54例，M62例。另外选取5例缺铁性贫血及5例正常人。治疗方法按标准急性髓系白血病化疗方案诊治。 　　2 方法 　　2.1 细胞采集与RNA提取：取骨髓涂片同时取肝素抗凝骨髓1ml，用PH7.2~7.4磷酸盐缓冲液稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，用PH7.2~7.4磷酸盐缓冲液反复洗涤细胞后，用TrizolRNA提取液裂解后-80℃保存至RNA提取。 　　2.2 PCR引物由中国科学院上海细胞生物研究所协作提供。 　　WT1引物（外引物）序列为: 　　上游引物：5′-GGCATCTGAGACCAGTGAGAA-3′， 　　下游引物：5′-GAGAGTCAGACTTGAAAGCAGT-3′； 　　β-actin引物（内引物）序列为: 　　上游引物：5′-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3′， 　　下游引物：5′-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。 　　2.3WT1的对照组以慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞???WT1阳性对照，以无模板PCR产物为阴性对照，以β-actin为内部标准。参照Inoue和Tamaki的方法，取4.0μg总RNA进行逆转录反应，反应体系为30μl。取5μl cDNA进行WT1和β-actin的PCR扩增，体系为100μl。WT1和β-actin的PCR条件为：变性，94℃，1分钟；退火，WT1 63℃，β-actin 60℃，1分钟；延伸，72℃，1.5分钟，扩增WT1 30个循环，产物为481bp，扩增β-actin 20个循环，产物为540bp。K562细胞cDNA经一系列稀释后的RT-PCR证实，该条件下WT1的检测敏感度为10-4以上。PCR扩增后，取10μl PCR产物在琼脂糖凝胶中电泳(150V，60分钟)，然后用GDS 8 000凝胶成像分析仪分析结果。 　　2.4 数据分析:设定K562细胞的WT1 mRNA表达量为1.0，用β-actin校正后，计算出患者WT1 mRNA与K562细胞之间的相对表达量(患者WT1 mRNA的RT-PCR电泳扫描值/K562细胞WT1 mRNA的RT-PCR电泳扫描值)。组间差异性检验采用χ2检验，P＜0.05为有显著差异。 　　3 结果 　　正常人骨髓单个核细胞未检测出WT1 mRNA表达。40例患者中，33例可检测出不同程度的WT1 mRNA表达，阳性率为82.5%。其中2例M0，1例M1，1例M3，1例M4及2例M6均阴性。 　　所有患者除M3采用砷剂治疗外，其余采用标准DA：柔红霉素+阿糖胞苷方案化疗，27例完全缓解(CR)，其中，23例CR后WT1 mRNA在检出值以下，占69.7%；10例部分缓解(PR)，其中，7例PR后WT1 mRNA在化疗前检出值以下，占21.2%；3例无效(NR)，WT1 mRNA与化疗前比较变化不大。完全缓解患者中4例仍可检测出WT1 mRNA的较高表达，均在6个月内复发。CR后复发的4例患者，WT1 mRNA均再次升高。CR患者与未缓解患者之间，化疗前WT1 mRNA水平无显著差异(P＞0.