巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞增殖影响.docVIP

巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞增殖影响 　　摘 要：如何能够促进软骨细胞的增殖是研究防治骨性关节炎（Osteoarthritis,OA）的重大课题。采用体外培养兔软骨细胞的方法，在培养过程中加入巴戟天多糖；实验结果证实巴戟天多糖能够促进软骨细胞增殖，以1?25 μg/mL的浓度为最优，巴戟天多糖促进软骨细胞的增殖作用可能与其使细胞增殖核抗原（PCNA）的表达增加有关。 　　关键词：巴戟天多糖；体外培养；软骨细胞；增殖 　　中图分类号：G804.4文献标识码：A文章编号：1007-3612(2007)09-1216-03 　　骨性关节炎（osteoarthritis，OA），又称骨关节病，据统计，该病在中老年人群中发病率高达60%～80%，而该疾病的致残率可高达53%，被称为人类“下半生疾病。 骨性关节炎（OA）的病因病机目前还不是很清楚，但最终都是由于软骨细胞的过度凋亡，进而导致软骨的破坏。在巴戟天的各种成分中以多糖的含量为最多，林励［1］??分析出5 a生巴戟天总糖含量在60％左右。本研究在前期工作的基础上拟通过对兔软骨细胞行体外培养研究其增殖及生长特性；通过观察巴戟天多糖对体外培养兔软骨细胞增殖的的影响，以探讨巴戟天多糖对兔软骨细胞增殖影响的生物学机制及其作用机理，进而阐述巴戟天强筋骨、祛风湿的机制，为新药开发提供理论依据。 　　 　　1 实验材料与方法 　　 　　1．1 实验材料 　　1．1．1 实验动物 3周龄大耳白兔（海淀区通利试验动物养殖场提供），皆为雄性。 　　1．1．2 主要试剂 高糖DMEM 培养基(Gibcol 公司)、胎牛血清（FCS, HyClone）、青－链霉素(华北制药股份有限公司)、胰蛋白酶（1：250, AMRESCO）、Ⅱ型胶原酶（Gibcol）、噻唑蓝（MTT, AMRESCO）、二甲基亚砜（DMSO，天津科密欧化学试剂开发中心）、链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合体(SABC)免疫组化试剂盒（Boster公司）小鼠抗大鼠增殖细胞核抗原PCNA单克隆抗体(中杉金桥公司)；兔抗小鼠IgG二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(中杉金桥公司)、巴戟天多糖（福建中医学院郭素华教授惠赠，纯度94.7％）。 　　1．1．3 主要仪器 AGl04电子分析天平(德国MTTLER-TCLEDO)；Φ690酸度计(德国BECKMAN)；SZ-93自动双重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)；85-1l恒温磁力搅拌器（常州国华电器有限公司）；LDZX-40H全自动压力灭菌消毒器（上海申安医疗器械厂）；TGL-16C水平离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；1 000 mL反复用过滤装置、手动真空泵(美国NalGene)；GBB16二氧化碳培养箱(德国Heraeus)；SW-CJ-2FD净化工作台(苏州安泰空气技术公司)；ZW-A微型振荡器(常州国华电器有限公司)；ELX808酶联免疫检测仪(美国BIO-TEK)；电冰箱(SIEMENS) ；IX70 倒置式系统相差显微镜(日本OLYMPUS) ； HU-12A透射电子显微镜（日本HITACHI）；P20、P200可调移液器（Eppendorf）；96孔培养板，250 mL密封旋盖斜颈细胞培养瓶；注射器针头滤器，0.22 μm滤膜（北京华美），流式细胞仪(Becton Dickinson FACScan,USA)等。 　　1．2 实验方法 　　 　　1．2．1 软骨细胞的分离与培养 3周龄乳兔1只,体重200～225 g,皆为雄性。引颈致死,八四消毒液浸泡消毒10 min。无菌条件下从肱骨头、股骨远端和胫骨近端关节面切取软骨,剪碎成大小相对一致的颗粒(1mm?3左右)。于平皿内用D-Hanks液冲洗3次,将软骨颗粒移入50 mL消化小瓶内。加 　　投稿日期：2007-01-22 　　基金项目：国家自然科学基金课题。 　　作者简介：黄涛（1973－），男，辽宁人，博士，研究方向运动创伤学。入0.25%胰蛋白酶6 mL,于37℃恒温水浴振荡器内消化30 min。加入用DMEM配制的0.2% Ⅱ型胶原酶6 mL于消化小瓶内,于37℃恒温水浴振荡器内消化3次，每次60 min。将每次消化所得软骨细胞悬液稍作吹打, 收集于离心管中，经200目筛网过滤，离心(1000rpm)5 min后弃上清, 用DMEM洗涤两次,最后以软骨细胞培养基（高糖DMEM，含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10%FCS）配成软骨细胞悬液。软骨细胞按2.5×10?6细胞/瓶接种于培养瓶内,将培养瓶放置于孵箱内。培养条件为37℃、5%CO?2浓度和饱和湿度。自接种后第3 d起隔日更换培养基。当细胞90％融和时用0.125