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时间分辨荧光免疫分析法测定甲胎蛋白临床评价 　　（抚顺市中心医院，辽宁 抚顺 113006）?? 　　 　　摘 要：目的：评价时间分辨荧光免疫分析法测定甲胎蛋白的临床应用价值。方法：分别用时间分辨荧光免疫分析法和酶联免疫吸附法进行AFP测定，进行相关性分析、精密度试验和线性分析。结果：两法呈正相关，都有较好的重复性，但时间分辨荧光免疫分析法的CV值明显小于酶联免疫吸附法，时间分辨荧光免疫分析法比酶联免疫吸附法具有更宽的检测范围。结论：应用时间分辨荧光免疫分析法检测AFP，具有灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，有着良好的发展前景。? 　　关键词：甲胎蛋白；时间分辨荧光免疫分析；酶联免疫吸附? 　　中图分类号：R446.6文献标识码：A文章编号：1673-2197（2009）03-0104-02? 　　 　　甲胎蛋白（AFP）是胚胎发育早期的一种主要血清蛋白，分子量约68000，由96％蛋白质和4％的碳水化合物组成，成人由肝细胞产生，血清中含量极微。AFP是诊断肝癌最特异的标志物[1]，其灵敏度和特异性已经达到甚至远远超过CT、MRT、同位素扫描、超声波检查和血清酶学检查，同时检测孕妇血清中的AFP含量可用于神经管缺损畸胎的筛查。这些领域均须对AFP进行定量测定，临床上检测AFP的方法有很多，本文采用时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）和酶联免疫吸附法（ELISA）对65份血清进行AFP测定，报告如下。? 　　 　　1 材料与方法? 　　 　　1.1 病人与标本? 　　本院2007年8月-12月收治的65例肝癌患者，血清学AFP检测阳性，经影像学、组织病理学检查确诊为原发性肝癌，抽取肝癌住院患者晨血5mL，EDTA抗凝。将其中15份血清混合后分装（用于精密度试验），置于-20℃冰箱中保存，集中测试。? 　　1.2 仪器与试剂? 　　TRFIA采用WALLAC公司生产的AutoDELFIA1235型全自动时间分辨荧光分析仪，测定试剂盒为苏州新波生物技术有限公司生产，自带标准物，检测过程均按照试剂盒说明书进行操作，ELISA采用美国Bioeheek公司产品，定量试剂盒为郑州博赛生物工程有限责任公司生产。? 　　1.3 检测方法? 　　（1）TRFIA。AFP标准品和样品25μL／孔→分析缓冲液200μL→室温慢速振动60min→洗板2次→已稀释（1∶50???的Eu3+标记溶液200μL→室温慢速振动60min→洗板6次→增强液200μL→室温慢速振动孵育5min→测定荧光值，自动计算AFP值。? 　　（2）ELISA。稀释液100μL/孔→血清样本20μL→37℃孵育30min→洗板4次→酶标抗体150μL/孔→37℃孵育30min→洗板→显色→酶标仪450nm读数测定，自动拟合曲线并计算AFP含量。? 　　1.4 统计学分析? 　　用SPSS13.0进行数据整理和统计分析，P0．05），直线回归方程为：Y（TRFIA）=0.938X（ELISA）+0.988，r=0.94，两法呈正相关。? 　　2.2 精密度试验? 　　参照NCCLS的精密度评价方案[2]，用时间分辨荧光免疫分析法和酶联免疫吸附法分别对高、中、低3个浓度（参考值分别为800μg／L，170μg／L，5μg／L）的AFP质控血清进行重复性试验。结果显示，两种方法都有较好的重复性，但时间分辨荧光免疫分析法的CV值明显小于酶联免疫吸附法，见表1。? 　　 　　2.3 线性分析? 　　取高值混合血清作6点倍比稀释，各复测3次，以原倍血清测定值为标准按稀释倍数算得其理论值，与两种方法实际测定值比较进行线性分析，TRFIA回归方程为：Y=1.04X+7.26，r=0.96；ELISA回归方程为：Y=0.63X+45.31，r=0.91。TRFIA在0.72～1078ng／L范围内线性良好；ELISA在4.21～535ng／L范围内线性良好。时间分辨荧光免疫分析法比酶联免疫吸附法具有更宽的检测范围。? 　　 　　3 讨论? 　　 　　时间分辨荧光免疫测定的基本原理是以镧系元素铕（Eu）螯合物作为荧光标记物，利用这类荧光物质寿命长的特点，延长荧光测量时间，待短寿命的自然本底荧光完全衰退后再行测定，所得信号完全为长寿命镧系螯合物的荧光，从而有效排除非特异性本底荧光的干扰而提高灵敏度。TRFIA法的固相技术，也是保持其灵敏度的一个重要因素，同时增强液在TRFIA中的作用特别重要，优质的增强液是提高检测灵敏度的另一个关键因素，加入增强液后，可以使Eu3+从反应复合物中解离下来，游离的Eu3+同增强液中的另一种螯合剂形成一种胶态分子团，这种分子团在激发光的激发下能够发出强烈荧光，信号可以增强100万倍[3]。TRFIA法的批内、