实验一时间分辨荧光免疫分析法检测乙肝病毒血清20120406.ppt

实验一时间分辨荧光免疫分析法检测乙肝病毒血清标志物 目的要求 掌握时间分辨荧光免疫分析的检测原理。 了解时间分辨荧光免疫分析仪的构造、工作原理。 采用时间分辨荧光免疫分析仪检测乙肝病毒血清标志物的操作过程。 一、实验原理 时间分辨荧光免疫分析（TRFIA，Time Resolved Fluorescent Immunoassay），又称解离增强镧系荧光免疫分析（DELFIA，Dissociation Enhancement Lanthamide Fluoro Immunoassay），是以镧系元素为标记物和时间分辨荧光测量相结合，建立的一种新的非放射性微量检测技术。 DELFIA在抗原抗体特异性反应的基础上，用三价稀土离子〔如铕（Eu3+）、钐（Sm3+）、铽（Tb3+）和镝（Dy3+）等〕及其螯合物作为标记物代替荧光物质、同位素、酶等标记物，标记抗原或抗体。标记的二抗可与抗原抗体复合物结合形成抗原-抗体-标记二抗免疫复合物，用时间分辨荧光分析仪测定复合物中稀土离子发射荧光的强度，根据荧光强度判断反应体系中待检测物质的浓度，达到定量分析的目的。 TRFIA原理图 TRFIA测定过程 （1）抗原抗体结合 （2）加入Eu3+螯合抗体，经温育后形成固相包被抗体-抗原- Eu3+螯合抗体复合物。 （3）加入酸性增强液，使Eu3+从免疫复合物中解离，形成新的微囊。它在340nm激发光照射下，发射出613nm荧光。 乙型肝炎病毒表面抗原测定原理 采用双抗体夹心时间分辨荧光免疫分析法（IFMA）法定量检测人血清乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）。 以单克隆抗-HBs抗体包被反应板，用铕标记试剂（DTTA-Eu）标记抗-HBs。 待测样本加入反应板微孔后，样本中的HBsAg与包被于微孔表面的单克隆抗体结合。 洗涤后，加入铕标记的抗-HBs（抗-HBs- DTTA-Eu），抗-HBs- DTTA-Eu与结合在板上的HBsAg反应，在微孔表面形成免疫复合物：抗-HBs-HBsAg-抗-HBs- DTTA-Eu。 洗涤除去游离的铕标记抗-HBs，加入增强液将复合物上的Eu3+解离到溶液中，并与增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物。 荧光强度与样本中的HBsAg浓度成正比，通过剂量-反应曲线得出样本HBsAg浓度值。 乙型肝炎病毒e抗体测定原理 采用中和抑制时间分辨荧光免疫分析法（IFMA）法定量检测人血清乙型肝炎病毒e抗体（HBsAg）。 用多克隆抗-Hbe抗体包被反应板，用铕标记单克隆抗-Hbe，定量加入待测样本及HbeAg中和抗原。 若标本中有抗-HBe时，HbeAg将被中和使最后形成的抗Hbe-HbeAg-铕标记抗Hbe复合物减少。 增强液将标记在抗体上的Eu3+解离到溶液中，Eu3+和增强液中的有效成分形成高荧光强度的螯合物。 荧光强度与样本中的抗HBe浓度成反比，通过剂量-反应曲线得出样本抗HBe浓度值。 二、实验材料和用品 10个待测样本 试剂盒 乙型肝炎病毒表面抗原定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法） 乙型肝炎病毒e抗体定量测定试剂盒（时间分辨荧光免疫分析法） 所需仪器包括微量移液器、离心机、振荡仪、洗板机、时间分辨免疫分析仪。 三、实验内容 （一）待测样本中HBsAg含量的检测 （二）待测样本中HBeAb含量的检测 （一）待测样本中HBsAg含量的检测 1. 试剂的准备——配制洗涤液：将40ml浓缩洗涤液稀释25倍，配制成1×工作用洗涤液。 2. 将试剂从冰箱中取出，取出检测所需数量的包被板条平衡至室温，分小组分别标记（如：1#、2#、……11#等）。 注：每组用校准品做一个标准曲线，每个同学做一个待测样本。 3. 分别取100μL校准品和待测样本加入相应的孔中，并加贴封条。 4. 孔号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11中，分别加入校准A、校准B、校准C、校准D、校准E、校准F、样本1、样本2、样本3、样本4、样本5。 注意：加样时，一定要注意加入顺序，从左至右依次加入！ 5. 置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育40分钟。 6. 配制铕标记物工作液：按检测所需将浓缩铕标记物稀释50倍备用。 7. 孵育40分钟后，弃掉孔中液体，洗涤，每孔加液360μL，弃掉孔中液体，拍干。重复以上洗涤4次。 8. 拍干孔中残余液体，每孔加入100μL铕标记物工作液，并加贴封条。置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育40分钟。 9. 按步骤7洗涤，重复洗涤6次。 10. 拍干孔中残余液体，每孔加入100μL增强液（加样过程中不要碰到小孔边缘），并加贴封条。 11. 置于振荡仪上缓慢振荡，室温孵育5分钟。 12. 在时间分辨免疫分析仪上检测荧光（在半小时内完成）。 使用专用软件根据荧光强度计算各标志物浓度。