层层组装聚磷酸酯与质粒多层膜作为可控基因传递体系的研讨.pdfVIP

摘要 摘要 在组织工程和再生医学中，治疗疾病和创伤的方法往往需要传达信号促进 细胞的增殖和控制细胞的死亡。这些信号包括促进细胞黏附和细胞相互通讯的 固定的配基、水溶性因子。现存很多体内体外的体系都能够向细胞中传递水溶性 生长因子。然而，由于蛋白质的不稳定、易变性，体内传递不能够达到天然蛋白 质的治疗效果。应用基因治疗的方法来传递生长因子已经引起了人们的广泛重 视。这种方法利用DNA载体转染细胞，并利用细胞做为生产治疗蛋白的机构。 基因治疗载体分为两类，病毒类和非病毒类。和病毒载体相比，合成聚合物载 体可以大大降低毒性，但是它们的局限在于表达持续的时间和区域的限制。为 了在非病毒载体中控制持续时间和基因表达的区域，一种办法就是将DNA组分 固定转载在聚合物材料的局部位置，这样的聚合物材料就能提供一个局部传递 DNA的平台。 本文利用聚磷酸酯和质粒DNA通过静电组装构建了可以控制释放活性质粒 DNA的多层膜，研究了成骨细胞在膜表面的黏附生长以及薄膜诱导细胞的持续 转染表达。 首先，利用层层自组装技术，分别将聚阳离子聚乙烯基亚胺(PEI)，阳离 多层薄膜。首次通过实验证实了阳离子型聚磷酸酯(PPE．EA，PPE．HA)和聚阴 离子聚苯乙烯磺酸钠(PSS)能够静电组装成多层薄膜。 其次，在前面实验基础上，进一步利用层层组装方法将PPE．EA和DNA静 电组装成多层膜。其中PPE．EA属于一类阳离子型聚磷酸酯，它们主链上的酯 键能够在水中降解。这种聚合物的阳离子性能够和DNA进行静电组装成膜，并 且通过膜中聚合物的降解导致膜本身的解组装。我们通过UV和QCM．D跟踪测 试了PPE．EA和DNA静电组装的整个过程，AFM图像显示了沉积的 PPE．EA／DNA膜层层之间存在穿插结构。 将PPE．EA／DNA膜在37oC，PBS中培养，发现薄膜发生降解，同时也将 DNA释放到培养溶液中，整个降解过程持续达到60天以上。AFM图显示，薄 膜的降解是由膜表面颗粒的脱落开始，逐步发展到薄膜内部。TEM照片显示， 降解释放产物为尺寸小于100nnl的颗粒，结合凝胶电泳实验可以证实这些颗粒 状产物是PPE．EA／DNA复合物为主。特别是，凝胶电泳图和转染实验结果都证 实这些释放的质粒仍然保持了一定的生物活性。 最后，为了测试PPE—EA／DNA膜在表面能否促进细胞的局部和基于表面的 体外细胞传递，我们将成骨细胞种植到薄膜表面培养。测试表明，成骨细胞在 摘要 PPE．EA／DNA膜表面进行黏附生长，而且膜表面能够促进成骨细胞功能化。实 验证实，在有血清存在的情况下，薄膜释放的DNA能够诱导成骨细胞进行持续 高水平的转染表达。流式细胞仪计数分析显示表达绿色荧光蛋白的阳性率达到 30—50％，释放DNA传递的周期持续了40天。 此外，我们对阳离子型聚合物的合成方法进行一些改进。采用了用叔丁氧碳 基保护的乙醇胺和2．氯．2．氧．1，3，2．二氧磷杂环戊烷反应得到胺基被保护的单体 保护即得到阳离子型聚合物PPEEA。这种新的合成方法很有潜力作为合成不同 分子量的阳离子型聚磷酸酯的制各路线。 综上所述，我们通过层层自组装方法构建了聚磷酸酯(PPE．EA)／质粒DNA 膜，在细胞生长环境中薄膜的降解释放能够介导其表面生长的成骨细胞持续的 高水平的转染表达。这种可生物降解的多层膜将用于实现局部和持续的DNA传 递，也为移植材料的表面修饰提供了另一种办法，有潜力应用于组织工程而诱 导产生长效的基因表达。 关键词： 基因传递层层自组装生物可降解聚磷酸酯组织工程 H Abstract ABSTRACT Tissue fordiseaseandtrauma engineering treatments to requiressignaling cell orcontrolcellfate．The