生物质谱新技术及其在疾病蛋白质组研究中的运用.pdf

复旦大学博士论文 摘磊 本博士论文工作的主要贡献为发展了蛋白质凝胶内酶切方法以及胶内酶切 产物豹在线预浓续技零；爨多}对瓣型分孔笼规耪糕在MALDI孛麴建用也避幸亍了 研究；利用基于双向电泳和生物质谱的方法策略对缺血心肌线粒体以及高、低转 移潜§2jI于薅组织邀芎亍了差异蛋白矮组分攒。 后基因组学的主要流派蛋白质组学目前显得相当活跃。蛋白质组学分离和分 辑维蕤与缀织缒全嫠蛋鑫舞壹接找到一缀鼗足缝凌麓蛋冬，莠疆究宅褒与麓能基 因(组)的内在联系。在目前功能基因尚不很清楚的情况下，直接发现功能蛋白 缀蹙有重蘩楚意义。嚣蘸，蛋自矮缀学静磺究主要集串在遴过对蘩鑫蒺蛙矮、丰 度的考察来揭示宦的功能，进而找到与人类重大疾病相关的差异鬣白，使之成为 药物簿选瓣靶分予，指导麓嚣组弱分辑，瓣不是投仅尾蕤DNA序翔分板爨维票。 蛋白质组学也正在成为分析化学研究领域的最前沿研究而虽白质组学的科 学磷究之掰浚髓够取褥蓬勃斡发溅，主要依赖予离遽量分离和分轿羧本的焚疆毪 进步。首先是双向凝胶电泳技术的完善，使得蛋白质的大范围、高通量分析成为 可能。其次是囊谗技术茏英是较眩离技本豹发曩，谴之袋必捡溅螯鑫震分予懿重 要手段。最后是生物信息学的建纛使得国际性的科学大协作得以形成。目前，世 嚣各主要鬻家都不赘巨瓷进行蛋巍凄缀豹磷究。鬃螽爱缀学骚究瓣逡一多深入， 将对了解疾病的发生和药物的筛选起到决定性的作用。 本论文工作彀括两个都分：第一部分为蛋自餍组学技术平台的建立与发展， 建立了基于双向电泳和质谱的蛋囱质组学技术平螽，对胶内酶解方法以及冀浓缩 方法进章亍7改进和发震，并对无机MAI D]基覆豫了初步磷究。第二部分为疾病 比较蛋白质组初探，利用旗于双向电泳和艇物质谱的方法策略对缺血心肌线粒体 戳毅高、低转移潜能嚣癌缱织遴行了魄较骚自蒺缀分褫。 第一郝分蛋囱质组学技术平台的建焱与发展 聚丙烯酰胺凝胶电泳，包括一维和二维，是目前蛋白质研究中用来分离复杂 蛋邀体系戆最重簧携手段。瑟对黢上蛋自遴蠢黢肉薅解以及凄谱分搴厅，遵懑经残 为复杂体系中蛋囱鉴定的最常用的方法。由于考玛斯亮蒇的存在会影响酶解反 应，掰有现有豹胶疼酶织方法都要浓在酶孵反应之戆獭底滁去凝黢中魏考憋巅麦 蓝。这个过程增加了工作擞，耗时而且会遗成蛋白燕失，影响蛋白搽定的灵敏度。 复旦大学博士论文 本工作提出了一种简化的胶内酶解方法，在酶解前不需除去考马斯亮蓝。利用简 化方法对500BSA进行酶解，并用HPLC／ESIMS进行分析。结果表明使用简 ng 化方法时酶解仍然可以有效进行。另外，考马斯亮蓝在反相HPLC中有强保留， 不会与肽段同时洗脱，所以不会对HPLC．ESIMS分析造成干扰。利用一系列不 同上样量的马心肌红蛋白对简化方法与传统方法进行了比较，发现简化方法倾向 于产生更多的胰蛋白酶漏切位点，并可以因此提高序列覆盖率。对简化方法在 脱以防止考马斯亮蓝与肽段同时洗脱。50 BSA可以得到令人满意的结果，显 ng 示了简化的方法可方便地用于MALDI—TOFMS检测，并拥有足够的灵敏度。用 该方法对大鼠心肌线粒体蛋白双向电泳图上的两个蛋白点进行了成功鉴定，表明 简化方法完全可以适用于实际生物样品的分析。 在胶内酶解产物的质谱鉴定前，通常需对样品进行浓缩。常规的浓缩方法费 时费力，而且会由于容器表面吸附造成大量样品损失。本论文发展了一种基于强 阳离子交换色谱(scx)的凝胶内酶切产物的在线预浓缩方法，可以方便地应用于 恰好与SCX肽段吸附的条件相吻合，因此肽段提取液可以不经过任何处理直接 用SCX柱浓缩，然后用lM醋酸铵溶液将吸附的肽段洗脱进入反相LC．MS系 统进行分析。独特设计的预浓缩，分析体系利用两个六通阀将SCX和反相色谱相 连，可以很方便地实现30倍的在线预浓缩。利用100ng的胶内牛血清蛋白对该 方法进行了验证，与传统的浓缩方法相比，该方法可以获得9个肽段，而传统的 冷冻抽干方法仅得到5个。其原因有两点：(1)新方法可以大大减少传统方法的 样品干燥和转移过程中由于容器表面吸附引起的损失。(2)在SCx浓缩过程中， 可以除去样品中的非离子性杂质，有利于改善样品峰的信噪比。另外