生物质谱的新技术与新方法的研讨.pdf

生物质谱的新技术与新方法的研究 摘要 r ～、文随着人类基因组计划的完成，生命科学的研究重点转向了后基因组时代，蛋 ～ 白质组学研究已成为最重要的生命科学研究领域之一。蛋白质组的研究对象是一 个细胞或组织中所表达的全部蛋白质。目前，蛋白质组学的研究主要集中在通过 对蛋白质性质、丰度的考察来揭示它的功能，进而找到与人类重大疾病相关的差 异蛋白，使之成为药物筛选的靶分子。蛋白质组学的研究方法，主要依赖于分离 分析技术和检测技术的突破性发展。首先是两维凝胶电泳技术的完善，使得蛋白 质的大范围、高通量分析成为可能；其次是质谱技术，两种软电离技术ESI和 MALDI的发展，使之成为检测蛋白质分子的最重要手段； 的繁荣使 得基因组和蛋白质组研究所获得的高通量的数据得以有效 本论文根据当前蛋白质组学研究的热点问题，对其方法学及应用进行了以下 方面的研究：发展了一种集分离和检测于一身的高通量蛋白质研究技术一毛细 管等电聚焦电喷雾质谱法；把相关原理应用于质谱CID谱图的数据解析中，提 出了一种新型的模式相关算法，大大提高了利用质谱来测定多肽的氨基酸序列的 易用性和准确度：利用毛细管电泳、高效液相色谱、HPLC--MS和时间分辨ESI 质谱法对蛋白质与蛋白质反应、蛋白质去折叠进行了研究；研制了一台圆柱形离 子阱装置，对付里叶变换检出技术进行了初步研究。 r —、＼、j本论文共分五章，主要内容摘要如下： ＼ 第一章主要综述了当今蛋白质组学研究中的关键技术——生物质谱及以生 物质谱为核心的相关技术，并综述了生物质谱在蛋白质学中的应用。自从ESI 摘要 在第二章所述的研究工作中发展了一种极具潜力的蛋白质两维分离鉴定新 技术：毛细管等电聚焦(CLEF)一质谱(MS)联用技术，并利用该技术得到了 同2D相类似大肠杆菌全蛋白的2维谱图。本论文工作采用特制的等电 聚焦系统和在线的CLEF--MS接口，创新地提出与实现了聚焦毛细管和电喷雾 针一体化设计，因而在聚焦和测定的转换过程中不用切断聚焦高压，只需调节电 喷雾针的位置，整个过程可在15s之内完成，聚焦好的蛋白质不会散焦，整个过 程操作简便，重现性高。利用标准蛋白溶液，实验得到了最佳的聚焦时间、两性 电解质浓度、聚焦溶液流出速度、缓冲溶液流速等，并根据CIEF--MS的特殊 要求，实验得到了最佳的质谱测定条件。针对CIEF--MS对样品溶液低盐、高 稳定性的特殊要求，探索并得到了一套实用的样品处理方法，为利用CIEF—Ms 进行实际样品测定奠定了基础。利用此技术已经得到了较好的大肠杆菌全蛋白的 2维谱图。 第三章所述的论文工作提出了一种基于模式相关原理的新算法，用于生物质 谱的蛋白质CID谱图的解析工作，可以从肽段的CID谱图中自动找出可能的氨 基酸序列，具有准确度高、容错性好等优点。该算法主要特点在于：1、在传统 的相关算法的基础之上发展了一套模式相关技术，把肽段在质谱CID中的断裂 规律融于相关得分的计算中，使得可能氨基酸序列的搜索高效、准确并具有较高 的容错性；2、序列模式的产生是一个自动迭代的过程，不需要人工干预；3、可 以对未知蛋白的氨基酸序列进行预测。通过该算法对大量已知蛋白酶解肽段的 CID谱图进行了解析，研究表明其既具有传统相关算法的高容错性、高准确度的 novo算法计算量小、可以预测未知蛋白的特性。在同PE公司 优点，又具有De 的SCIEXAPI165质谱所带的商用解谱软件的比较中具有明显的优势。 第四章中所涉及的工作主要利用质谱、毛细管电泳及高效液相色谱对蛋白质 的去折叠及蛋白质一蛋白质之间的反应进行了初步研究。主要研究内容如下：1、 利用毛细管等电聚焦技术对基因工程产物一碱性脂肪酶进行了纯度检验和等电 点测定，探索并得N-f一套实用的制作毛细管聚丙烯酰胺涂层的方法；2、利用 时间分辨一电喷雾质谱法对溶菌酶的四对二硫键的还原过程进行了动力学研究， 给出了近似的动力学规律；3、利用质谱对溶菌酶中甲硫氨酸的烷基化产物在CID 中的裂解过程及机理进行了研究；4、通过高效液相色谱对一