SOD酶提取分离和活性测定.pptVIP

实 验 六 大蒜细胞SOD酶的提取分 离与活性测定 在生命科学高度发展的今天，蛋白质、酶和核酸等生物大分子的结构与功能的研究是探求生命奥秘的中心课题，而生物大分子结构与功能的研究，必须首先解决生物大分子的制备问题，有能够达到足够纯度的生物大分子的制备工作为前题，结构与功能的研究就无从谈起。然而生物大分子的分离纯化与制备是一件十分细致而困难的工作。 与化学产品的分离制备相比较，生物大分子的制备有以下主要特点： ⑴生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。 ⑵许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。(影响因素多 ) 生物大分子的制备通常可按以下步骤进行： 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理化学性质。 根据实验目的，建立相应的可靠的分析测定、及制备方法，这是制备生物大分子的关键。 生物材料的破碎和预处理。 分离纯化方案的选择和探索，这是最困难的过程。 生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定。 产物的浓缩，干燥和保存。 大蒜SOD的提取及活性测定 试验目的： （1）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。 （2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。 （3）掌握离心机的使用。 实验原理:P64, 邻苯三酚在碱性条件下可迅速自氧化,释放出O2-,生成带色的中间产物,在420nm有最大吸收峰。邻苯三酚自氧化产生的中间产物在40s-3min这段时间，生成物与时间有较好的线性关系。 颜色深→SOD逐渐增多→颜色浅，即酶活力越大，颜色越浅。 试验试剂： 大蒜 磷酸缓冲液（PH7.8, 0.05mol/l)(PH8.3) 氯仿—乙醇混合液 冷丙酮 邻苯三酚 浓盐酸 操作步骤： 1、SOD提取：称取5g大蒜蒜瓣,加入石英砂研磨破碎细胞，加入15ml的PH7.8 0.05mol/L的磷酸缓冲液，研磨搅拌20分钟，使SOD充分溶解，6000rpm离心，弃去沉淀，得上清液。(留出1ml备用,准确量取剩余上清液体积,记录) 大蒜SOD的提取及活性测定 2、除杂蛋白 ：提取液加入1/4体积的氯仿－乙醇混合液搅拌10分钟，6000rpm离心15min去沉淀，得粗酶液。（取1ml粗酶液备用,精确测量剩余粗酶液体积） 3、SOD酶的沉淀分离：剩余的粗酶液中加入等体积的冷丙酮，搅拌15min，6000rpm离心15min，得到SOD酶沉淀。将沉淀 每管先加2ml磷酸缓冲液，溶解后在加3ml混匀。6000rpm离心15min，取上清得到SOD酶液。取1ml备用，其余量取体积。 4、粗酶液活性测定（邻苯三酚法） 提取液、粗酶液、酶液中SOD活力检测，具体步骤如下。 5、溶液中可溶性蛋白含量测定： 分别从1ml 备用的提取液、粗酶液、酶液各取0.3ml按以下倍数稀释,260nm/280nm测定吸光值,按公式计算蛋白质浓度. 提取液稀释:50 × 粗酶液稀释:20 × 酶液稀释:10 × 蛋白质浓度(mg/ml)=(1.45A280 – 0.74A260) ×稀释倍数 6、计算： 酶活力单位U/ml=2（OD1-OD2）×5/0.1 (1ml反应液中,每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达到80%时的酶量) 总活力U=活力单位×总体积 比活力U/mg=活力单位/蛋白质浓度 纯化倍数=粗酶液(酶液)比活力/提取液比活力 回收率=粗酶液(酶液)总活力/提取液总活力 7,试验结果讨论. * * 0.2 0.2 0.2 0.2 0 邻苯三酚 室温放置20min 1.7 1.7 1.7 1.8 2 蒸馏水 0.1 0.1 0.1 0 0 SOD提取液 3 3 3 3 3 PH8.3缓冲液 酶液 粗酶液 提取液 对照管OD1 空白管 试剂/ml 加入邻苯三酚后迅速混匀,准确计时4min,加一滴浓盐酸 停止反应,420nm测吸光值. OD2