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骨髓活检标本脱钙及除酸方法改良 (陕西省咸阳市中心医院病理科陕西咸阳712000)【摘要】骨髓病理在某些血液病的诊断中起着关键性的作用，但是由于骨髓塑胶包埋成本较高的缘故，好多医疗单位骨髓病理都没有作为常规工作开展，本文介绍应用50%的甲酸甲醛水溶液对骨髓病理标本进行脱钙处理2小时左右，并在切片染色前用5%的碳酸钠除去残留酸。本法简单、方便，低耗、高效。适合一般单位日常工作。【关键词】骨髓;活检标本;脱钙;除酸;改良【中国分类号】R361 【文献标识码】A【文章编号】1004-5511（2012）04-0471-01 在某些血液病的诊断中，骨髓病理起着关键性的作用。而对骨髓病理标本的包埋目前主要有2种方法，即：塑胶法和石蜡法。尽管塑胶包埋有着诸多的优点，但由于成本的原因，仅一个塑胶块成本就达20元，若对一个患者取2-3块组织，试剂成本就达40-60元，但只取1块组织，却极有可能漏诊或误诊，而石蜡包埋即使取样更多一点――3-5块，一个石蜡块就能完成，成本不足1元。且在制作塑胶切片时，对切片机损坏极大。这也是目前好多单位仍然采用石蜡包埋的原因。石蜡包埋前，由于组织内含有大量的钙盐，必须对组织进行脱钙处理。目前常用的脱钙方法有EDTA螯合脱钙、电离脱钙和酸脱钙。EDTA脱钙时间太长；电离脱钙需要专门设备；方便、快捷使得目前仍然以酸脱钙为主，酸脱钙的原理就是使酸和组织中的钙反应结合，从而达到脱钙的目的。 其中包括无机强酸脱钙、无机强酸和有机酸混合脱钙、Bouin氏液和其它有机弱酸脱钙等。由于无机强酸脱钙，时间不宜控制，需不断用针刺观察，以防止脱钙处理过度，导致组织报废。Bouin 氏液和其它有机弱酸酸性太弱，时间过长，不能及时完成工作,影响诊断及时进行。因此我科自2011年3月以来一直选用甲醛甲酸液对组织进行脱钙处理。病例、试剂和方法1、标本来源：2011年3月-12月病理活检标本180例。2、试剂:2.1（1）50%甲酸甲醛水溶液：50ml甲酸加入40%的甲醛10ml后，加水至100ml.（2）5%碳酸钠水溶液：取5g碳酸钠加入100ml蒸馏水中。（3）Harris苏木精染液配方如下：苏木精1g，无水乙醇10ml，硫酸铝钾20g，蒸馏水200ml，氧化汞0.5g，冰醋酸8ml。配制步骤：先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，再将这两种液体混合后煮沸（约1min），离火后向该混合液中迅速加入氧化汞，并用玻璃棒搅拌至染液变为紫红色（此时有大量气泡产生，故容器宜大，以防液体溢出），随即用冷水冷却至室温，然后加入冰醋酸并混匀，过滤后使用。 (4) 吉姆萨染液的配置：将吉姆萨粉末1g先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全部(66mL)剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温2h。然后再加入甲醇(66mL)，搅匀后保存于棕色瓶中。母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。临用时用pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释10倍。（5）1%酸性品红水溶液：取1g酸性品红粉加入到100ml蒸馏水中。2.2 其它试剂:免疫组织化学试剂均购自福州迈新生物技术开发有限公司3、方法过程：骨髓病理标本经过Bouin氏液充分固定，然后放入50%的甲酸甲醛脱钙液，根据组织大小及质地2小时左右，即1.5-2.5小时完成脱钙，不用反复观察。 标本脱钙完成后，冲洗半小时后都进入脱水机进行处理脱水、透明、浸蜡处理，而后包埋，以2um进行切片。染色步骤：1）切片65℃左右烘烤40分钟左右。2） 石蜡切片经二甲苯脱蜡2次，每次3分钟。3）放入100％、95％、90％、80％、 70％ 梯度的乙醇水化，每浓度2次，每次2分钟。 4）水洗后，切片用5%的碳酸钠处理3-5分钟方可染色。5）HE染色过程为：Harris苏木素染色5分钟，流水冲洗3-5分钟，伊红染色5-10秒，脱水、透明、封固。 　　HGF染色过程为：Harris苏木素染色2-3分钟，流水冲洗3-5分钟，姬姆萨染2-3分钟，流水冲洗3-5分钟，酸性品红染色10-15秒，流水冲洗3-5分钟，75%、85%、95%乙醇3-5秒，无水乙醇1分钟脱水、透明、封 固。结果：本法处理的细胞结构完整，染色效果理想，各系各阶段细胞区分明显，核浆对比清楚。免疫组织化学染色：常规操作如下：1） 标本以2um厚连续切片，全部切片在 60℃低温烘烤1～2小时备用。2） 石蜡切片经二甲苯脱蜡3次，每次10分钟。3） 放入的无水乙醇3次后水化，每次3分钟。 4）蒸馏水洗3分钟，5%的碳酸钠处理本法切片3-5分钟。5） PBS 3次，每次3分钟。6）3％H2O2去离子水（无色液体）孵育10分钟，以消除过氧化物酶活性。7） PBS3次，每次3分钟后，按照要求进行抗原修复。8） 滴加一抗