烟草对氧化胁迫的耐受性分析PPT.pptxVIP

生物化学与分子生物学专业 张鹏 ;文献摘要 引言 材料与方法 结果 讨论;由植物适应氧化应激(胁迫)的分子机制了解甚少。为了鉴定该适应的过程，我们对烟草叶片适应氧化应激进行了基因表达的综合分析。结合mRNA差异显示和cDNA阵列分析，我们估计至少有95个基因在烟叶适应氧化应激过程中它们的表达会改变，其中83 ％被诱发，17％被抑制。 53个序列标签序列分析表明，除了抗氧化基因，与生物和非生物胁迫的防御、细胞保护和解毒、能量和碳水化合物的代谢、新蛋白的合成和信号转导等相关的基因表达也被改变。大部分基因的表达增强，但是除了与光合作用和光调节过程相关的基因被抑制了。;在植物适应氧化胁迫过程中，观察到共调节基因的两个不同的群体（“早期” 和“晚期响应”基因调节子），这表明至少有两个不同的基因诱导途径的存在。这两个基因调节子对氧化应激也表现出的两种不同的表达模式。在适应胁迫的叶片部位“后期响应”基因表达增强，而“早期反应”基因的表达则不是。总之，我们的数据表明，对氧化应激的适应是与广泛的基因表达的调节相关联的一个非常复杂的过程。此外，我们的数据表明，除了防卫基因诱导，植物过敏加强了基因表达可能是适应氧化应激的一个重要因素。 ;植物处于非致死的生物或非生物胁迫时，通常会呈现对一般的，剂量相同的致死因子的耐受性，而这种现象被称为驯化（适应）或获得抗病性。这种诱导产生的胁迫抗性并不限于同一类型的胁迫，也有关于不同的应激之间的交叉耐受性的相关报道。由于许多胁迫条件导致细胞氧化还原失衡，有研究表明植物对氧化应激的防御有助于诱导对非生物和生物胁迫的耐受性，而且是交叉耐受性介导的关键成分。有个现象也说明这个概念，即适应热或冷的植物会呈现对病原体的抗性并对氧化应激产生更高的耐受性。;1、植物材料、培养条件和甲基紫精 (MV) Methyl Viologen处理 在100μmol m-2s-1的光子通量下，16小时的光照和8小时的黑暗，70%的相对湿度，恒温24°C的条件下生长5周，不同的植物中切出3个直径1cm的圆孔，近轴端施用12ml的甲基紫精溶液，对照组使用超纯水。使用电导仪测定叶盘离子渗漏溶液的导电性。 2、 RNA提取和RNA凝胶印记分析 3、差异显示 4、 DNA序列分析 ;1、烟草对甲基紫精的敏感性 为了鉴定植物中基因对适应氧化胁迫的差异表达，使用MV。虽然低浓度的AOS诱导防御反应，但高浓度的AOS导致细胞死亡。为了避免细胞恶化基因的表达，我们首先确定亚致死MV的浓度。为此，烟草叶盘上用不同浓度的MV，并监测溶质的电导率。;相比用水处理过的叶盘，0.2 μM和较低浓度的MV只造成较小的离子渗漏，即使经过42小时的培养也并没有观察到明显的损伤，（图1）。在随后的实验中，上述浓度的MV用于诱导对氧化应激的耐受性。大于0.2μM的浓度导致了大量的离子渗漏和细胞死亡（图1），并用于评估植物对氧化胁迫的耐受性。 ;2、亚致死剂量的MV处理使得烟草叶片对致死剂量的MV诱导的氧化胁迫产生适应性。 使用0.2μM MV或更低浓度（预处理）各种时期的烟草叶盘随后转移到含有致命剂量的MV溶液中做耐受性评估（处理）。当叶盘用0.1μM MV进行预处理17小时（含8小时黑暗期）并在一个11小时的处理后进行抗逆性评估，烟叶对MV的抗性非常显著（与水处理的对照组，实验组溶质电导率减少了40 ％）（图2A ）。为了测试这种对MV的耐性究竟不仅仅只是一种生理反应，还涉及核基因表达的改变，通过Northern杂交检测mRNA水平的抗氧化基因GPX和SodCc被检测。0.1μM MV预处理的叶片中这两种抗氧化基因都被诱导，并且在整个氧化应激的适应期样品中它们的的表达增强了（图2B）。这一观察结果表明，烟叶对 MV强加的氧化胁迫不仅是一种生理反应，还涉及核基因表达的改变，说明GPX和SodCc起到增强耐受性的作用。 ;3、对耐药性的烟叶做全基因组表达分析。 为了阐明氧化胁迫耐受性增强的的分子过程，进行了全基因组表达分析。通过mRNA差异显示技术对无论是水或0.1μMMV预处理17小时的烟草叶盘进行了对比。用80个引物组合，耐受性和无耐受性的样品中始终差异表达的大于150 bp的243个带（表1）被鉴定出来。对146个带的序列分析表明，50 ％的频带是含有两个或更多不同的cDNA片段的混合体。因此，源于这146个带的单一序列被重新扩增，摆着尼龙膜上，并与来自耐受性和无耐受性的烟草叶盘中的cDNA探针杂交。 对13个诱导表达的基因进行了测试，并通过RNA凝胶印迹分析来重新确认，验证cDNA微阵列分析的结果。 ;4、氧化应激处理过程中诱导基因的差异表达 对0.1μMMV预处理（驯化）和随后的1μMMV处理过程中的11个选择的基因的表达进