第21章常用分子生物学技术的原理及其应用PPT.ppt

常用分子生物学技术的原理及应用 The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology;第一节 分子杂交与印迹技术;核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。;：分子杂交与印迹技术的原理与应用；末端终止法测定DNA序列的原理； PCR(polymerrase chain reaction)技术原理；酵母双杂交技术的原理与应用；凝胶阻滞实验的原理与应用；染色质免疫沉淀实验的原理与应用；基因诊断与基因治疗。 熟悉：探针、DNA点阵、DNA芯片、基因文库；转基因技术、基因靶向灭活、转基因动物与克隆动物；基因诊断常用技术；基因治疗的种类。 了解：分子杂交技术的类别与应用；PCR技术的发展与类别；DNA自动测序技术； 标签蛋白沉淀实验；基因增补的治疗程序；疾病相关基因的功能克隆与定位克隆；RNA干扰技术。;;用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 ;二、印迹技术的类别及应用;其他： 斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip);;;三种印迹技术的比较;分子杂交实验;放射自显影照片;第二节;5?;Cycle 3;;模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+; PCR的基本反应步骤;利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段, 或与逆转录反应相结合，直接以组织和细胞的mRNA为模板获得目的片段； 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得序列相似的基因片段； 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。 ;利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。 ;Ｇ;将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度； 待测DNA片段既可克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。;逆转录PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。 RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 ;;;原位PCR(in situ PCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特异性探针进行原位杂交，即可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。 原位PCR方法弥补了PCR技术和原位杂交技术的不足，是将目的基因的扩增与定位相一种最佳方法。 ;;（三）实时PCR技术;2、实时PCR技术原理;*实时PCR用于基因拷贝数（模板数）分析的原理：;②、Ct值与起始模板的关系 ???? 研究表明，每种模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数(模板数越多，Ct值越小）。利用已知起始拷贝数的标准品并可分别测得Ct值，作出标准曲线，其中横坐标代表起始模板拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（或相反）。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始模板拷贝数。;;;;;③、Real Time PCR 定量方法： 绝对定量法：检测待测起始模板数的精确拷贝数，需事先制作标准曲线 相对定量法：在待测样品的初始模板数（靶序列）相对于参照样品的量的变化。如可作Ct值的比较，即比较CT法。 如比较原癌基因是否扩增，初始模板数是否增加？ 常用制作标准曲线的标准品：最好是含有与待测样品相同扩增片段的克隆质粒，或cDNA，还有纯化的PCR产物等 标准模板浓度通常选5个点，浓度呈递减或递增的梯度变化 ;总之， 模板DNA的量越多，荧光达到规定的阈值时所需的循环次数就越少，即Ct值就越小； Log 模板浓度与PCR荧光达到规定的阈值时所需的循环次数（ Ct值）呈线性关系，通过已知起始拷贝数（浓度）的标准品，可做标准曲线，根据所测得的待测样品的Ct值就可通过标准曲线计算出样品（未知样品）中所含的模板量（初始拷贝数）。;第三节;核酸序列分析的基本原理：;一、DNA链末端合成终止法;G;;G;Ｔ　　Ｔ　　Ａ　　Ｃ　　Ｇ　　Ｔ　Ｃ　Ａ　Ｔ; Sanger双脱氧链终止法引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ