基因工程-第4章-基因工程载体PPT.ppt

第四章 基因工程载体;; 载体（vector）是由在细胞中能够自主复制的ＤＮＡ分子构成的一种遗传成分，通过实验手段可使其它的ＤＮＡ片段连接在它的上面，而进行复制，作为基因工程的载体，必须具备以下几个性能： ;1、分子较小，可携带比较大的ＤＮＡ片段。 2、能独立于染色体而进行自主复制并且是高效的复制。 3、要有尽可能多种限制酶的切割位点，但每一种限制酶又要最少的切割位点（多克隆位点 multiple cloning sites ，MCS） 。 4、有适合的标记，易于选择。 5、有时还要求载体要能启动外源基因进行转录及表达，并且尽可能是高效的表达。 6、从安全角度考虑，要求载体不能随便转移，仅限于在某些实验室内特殊菌种内才可复制等等。 ;载体;质粒*;第一节 质粒（plasmid）载体  质粒是一种独立于染色体外的小分子环状DNA，一般大小约106～108D，可自身复制和表达，有的质粒还带有可做为选择性标记的抗药性基因，所以质粒经过适当改造后便可成为良好的载体。  作为载体的质粒大多是由天然质粒经人工适当改造而成的，目前已有多种经改造的良好的质粒载体。;　;质粒载体;一、质粒的生物学特性： 1、质粒DNA的构型： SC型 共价闭合环形DNA（cccDNA） OC型 开环DNA（ocDNA） L型 线性DNA（LDNA） 2、不同质粒的分子量大小差异相当显著： 106～ 108D 3、作为载体的质粒都含有三种共同的组分：复制基因（replicator）、选择性记号、克隆位点 ;L;4、质粒DNA编码着一些重要的非染色体控制的遗传性状。 抗性特征、代谢特征、修饰寄主生活方式的因子等。 5、质粒DNA的类型： 接合型和非接合型；含大肠杆菌素Col质粒和含抗菌 素抗性基因的R质粒；F因子和F`因子等。;6、质粒DNA的复制类型： 低拷贝的质粒（1～3）：严紧型复制控制的质粒 （接合型） 高拷贝的质粒（10～60）：松弛型复制控制的质粒（非接合型） 7、质粒的不亲合性 在同一个大肠杆菌细胞，一般不能同时含有两种不同的。也称为质粒的不相容性。 是指在没有选择压力的情况下，两种亲源关系密切的不同质粒，不能够在同???个寄主细胞系中稳定地共存的现象。 质粒的不亲合性分子基础，主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。;二、质粒载体的构建与类型 1. 天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。 在大肠杆菌中，常见的可用于基因克隆的天然质粒有ColE1、RSF2124和pSC101等，但存在一定的局限性。 ; 第一个用于基因克隆的天然质粒pSC101，它含有一个EcoR I酶切位点，一个四环素抗性选择记号（Tetr ），插入外源片断后不影响其复制功能，但该质粒分子量较大，拷贝数低只具有抗菌素抗性基因，无法使用插入失活技术选择重组分子。; ColE1质粒在其唯一的单切割位点EcoR I中克隆外源DNA片断后，可根据对大肠杆菌素E1的免疫性选择转化子，不能合成大肠杆菌素E1的菌落是具有重组质粒的转化子。但对大肠杆菌素E1的免疫筛选，在化学上是相当麻烦的。;2.质粒载体必须具备的基本条件 (1) 、具有复制起点； 自我增值的基本条件，一般具一个复制子。 (2) 、具有抗菌素抗性； 理想的质粒载体具有两种抗菌素抗性基因。 (3) 、具有若干限制酶切单一位点（CMS）； (4) 、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 低分子量的质粒易于操作，克隆外源片断 后仍能有效的转化给受体细胞同时低分子量的质粒对限制酶具有多种识别位点的几率也较低；较高的拷贝数可获得大量的克隆基因;以Ampr和Tetr为选择性标记，克隆位点在这两个选择性标记的单酶切位点上。选择AmprTets或AmpsTetr的重组子。; 3.质粒载体的选择记号 新陈代谢特性； 对大肠杆菌素E1的免疫性； 抗菌素抗性； 四环素抗性、氨苄青霉素抗性、 链霉素抗性、卡那霉素抗性 大多数质粒本身带有抗菌素基因； 抗菌素抗性记号便于操作、易于选择。;三、重要的大肠杆菌质粒载体 1、p