基因工程-第4章-续稿.ppt

基因扩增 在现代分子遗传学或基因工程中使用的基因扩增（gene amplification）这一概念，在不同的场合有不同含义，概括起来有如下5个方面的内容： 1、在体外应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术和合成的寡核苷酸引物，导致特定基因的拷贝数发生快速大量的扩增。 2、通过体外DNA重组，将目的基因插入到高拷贝数的质粒载体分子上并转化到适当的寄主细胞，于是在细胞内随着载体分子的大量复制，目的基因的拷贝数也得到了有效的扩增。 3、在有些外界环境因子的胁迫下，真核生物的有关细胞被诱发产生适应性反应，从而导致相应的保卫基因（protective gene ）产生明显的扩增。例如，使用高剂量的药物氨甲喋呤，便可导致二氢叶酸还原酶（DHFR）基因得到明显的扩增，因为这些基因的编码产物是氨甲喋呤的作用靶子。 4、程序基因扩增（ programmed gene amplification ）有时也会被真核生物细胞用来作为在特定的发育阶段合成高水平基因产物的一种手段。例如，在非洲爪蟾卵子形成过程中的rRNA基因的扩增情况。 5、在生物进化过程中发生的基因加倍与扩增，结果使相关的基因在基因组上聚集成簇。 以上5种不同类型的基因扩增，后4种是在天然状态下于细胞内发生的生理生化变化，唯有PCR技术才是人类自己在试管中模拟发生于细胞内的DNA复制过程。 聚合酶链式反应，即PCR技术，是美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis于1985年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法，也有人称之为无细胞分子克隆法。 5.1 PCR技术 5.5.1 PCR技术的发明 1869年瑞士的年轻医生Miescher就开始对核酸进行研究 1930年提出了DNA和RNA的概念 1953年提出了DNA双螺旋模型及其半保留复制 1971年Khorana等提出了PCR技术的思路 1985年K.B.Mullis发明了PCR方法 1986年PE-Cetus公司发明并提纯了耐热DNA聚合酶 1987年推出了PCR自动化热循环仪 1988年首先获得了基因工程方法生产的耐热DNA聚合酶 5.1.2 PCR技术的原理 PCR技术快速敏感、简单易行、其原理并不复杂，与细胞内发生的DNA复制过程十分类似。首先是双链DNA分子临近沸点的温度下加热时便会分离成两条单链的DNA分子，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTP）合成新生的DNA互补链。此外，DNA聚合酶同样需要有一小段DNA引物来启动‘引导’新链的合成。因此，新合成的DNA链的起点，事实上是由加入在反应混合物中的一对寡核苷酸引物在模板DNA链两端的退火位点决定的。PCR反应的最后结果是，经n次循环之后，双链DNA分子数，即两条引物结合位点之间DNA区段的拷贝数，理论上的最高值是2n。 5.1.3 PCR技术的特点 1、特异性强 单核苷酸的错误掺入程度很低，错配率一般只有约万分之一，足可以提供特意性分析。 2、敏感性高 能从100万个细胞中检出一个靶细胞，或对诸如病人敏感部位只含一个感染细胞的标本或仅含0.01pg的感染细胞的特异性片段样品均可检出。 3、快速 整个PCR操作过程需3-4小时即可完成。对检测样品纯度要求低，不用分离病毒，DNA粗制品及总RNA均可作为反应起始物。可直接应用于临床标本，如：血液、尿液、分泌物、脱落细胞、粪便、组织法粗制的DNA提取物的扩增检测，省去费时繁琐的提纯过程，扩增产物用一般的琼脂糖凝胶电泳分析即可。 4、简便 扩增产物可直接供作序列分析和分子克隆，摆脱了繁琐的基因分析方法。 5、可扩增RNA或cDNA 6、对起始材料质量要求低 7、具有一定程度单核苷酸错误掺入 Taq DNA聚合酶缺少3’ →5’核酸外切酶活性，因而不能纠正反应中发生的核苷酸错误掺入。与大肠杆菌聚合酶 ⅠKlenow 片段相比较，用Taq DNA聚合酶的反应发生错误掺入多些。由于发生错误的程度还要受反应条件的影响， 所以对于仅由该酶引发的错误很难精确估计。Tindall估计每9000个核苷酸掺入中发生一次错误，而每合成41000个核苷酸可能导致一次框码移位。 5.2 聚合酶链式反应的最适条件 5.2.1 Taq DNA聚合酶 Taq DNA聚合酶最初是由H.A.Erlish于1986年从一种生活在75℃的温泉中的细菌，即栖热水生菌（Thermus aquaticus）中分离纯化出来的。1988年，R.K.Saiki等人成功地将热稳定的Taq DNA聚合酶