柱前衍生-反相高效液相色谱法测定2-去氧葡萄糖含量.docVIP

柱前衍生-反相高效液相色谱法测定2-去氧葡萄糖含量 　　摘 要 [HS]采用对氨基苯甲酸乙酯为衍生化试剂，建立柱前衍生化反相高效液相色谱法（RP?HPLC）测定2?去氧葡萄糖的含量。结果表明，最适的衍生化条件为反应温度85 ℃，反应时间1.5 h，衍生化试剂（ABEE）和单糖（2?DG/Glu）的摩尔比为25∶1；色谱条件为色谱柱Hypersil ODS2 （250 mm × 4.6 mm，5 　　?SymbolmA@ m），流动相为0.02%TFA?乙腈（80∶20，V/V） ，流速1.0 mL/min，波长307 nm。本方法在1～700 mg/L?? ?浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系（r＝0.9999）；定量限（S/N＝10）及检出限（S/N＝3）分别为450和100 　　?SymbolmA@ g/L；平均加标回收率为?101.7%?；RSD为0.7%；日内及日间精密度均小于0.7%。表明本方法灵敏度高，测定结果准确，重复性好，可用于2?去氧葡萄糖样品的准确定量分析。 　　[KH*3/4D][H]关键词 [HS]2?去氧葡萄糖； 柱前衍生； 反相高效液相色谱法； 对氨基苯甲酸乙酯? 　　 　　[HT][HK] 　　[FQ（3?２,X,DY－Ｗ][CD15]? 2011?07?01收稿；2011?11?23接受? 　　本文系海洋公益性行业科研专项经费基金 （No.201005020），福建省科技重大专项经费基金 （No.省略 [HT] 　　 　　1 引 言? 　　2?去氧葡萄糖（2?Deoxyglucose，2?DG）是多种天然抗生素及抗肿瘤药物的药效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗衰老、止血及镇痛等??\[1,2\]?多种生理药理效应，在医药、食品、化妆品及科学研究领域??\[3,4\]?具有广阔的应用前景。建立2?DG的快速定量方法，对糖生物学与糖医学等科学研究及应用具有重要意义。? 　　2?DG的检测方法有离子色谱法和柱前衍生高效液相色谱法??\[5,6\]?。前者方便、准确，但通用性不佳；后者不仅测定结果准确，还可以克服其缺点。文献\[6\]曾采用对氨基苯甲酸乙酯（p?Aminobenzoic ethyl ?ester?，ABEE）衍生化法分离分析2?去氧葡萄糖，但所采用的色谱柱是耐碱性的C??18?柱，流动相为pH 9.0的硼酸钾缓冲液，这对常用的C??18?柱（pH＝2.0～8.0）几乎不适用。本研究采用0.02%三氟乙酸（pH 2.65）?乙腈为流动相，适用于几乎所有C??18?柱，并以等度洗脱代替梯度洗脱，缩短分析时间；文献\[7～9\]报道过的ABEE衍生化法所用的糖浓度都较高（25.6 mmol/L），未见采用低浓度糖溶液???生化的方法。本研究建立的低浓度（2 mmol/L）糖溶液衍生化的方法，为低浓度糖溶液的衍生化提供了参考。本研究采用柱前衍生?反相高效液相色谱法同时分离分析2?去氧葡萄糖和葡萄糖，方法具有通用性广、分析时间短、灵敏度高、测定结果准确、稳定性好等优点。2 实验部分? 　　2.1 仪器与试剂? 　　 　　Alliance 2695高效液相色谱仪（配2996二极管阵列检测器）, 3100单级四极杆液质联用仪; ?MicroMass? LCT Premier??TM ?XE高分辨质谱仪（美国Waters公司）；Bruker VERTEX?70 红外光谱仪; Bruker?400 核磁共振仪（德国Bruker公司）。? 　　2?DG（自制）；葡萄糖（中国药品生物制品检定所）；鼠李糖（99%），阿拉伯糖（98%），对氨基苯甲酸乙酯（99%），氰基硼氢化钠（95%）均购自Aladdin公司；三氟乙酸、甲醇、乙腈（色谱纯，Tedia 公司）；冰醋酸（分析纯，西陇化工股份有限公司）；超纯水（电阻率≥18.2 MΩ?cm，自制）。 　　2.2 色谱及质谱条件? 　　色谱条件：Hypersil ODS2 （250 mm×4.6 mm，5 　　?SymbolmA@ m）；柱温：25 ℃；进样体积：10 　　?SymbolmA@ L；流动相： 0.02%TFA?乙腈（20∶80，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：307 nm。? 　　质谱条件：电喷雾离子源（ESI）；电离电压（毛细管电压）?3.5 kV?；一级锥孔电压35 V；二级锥孔电压3.0 V；六级杆透镜电压0.1 V；源温度（Source temperature）120 ℃；脱溶剂温度350 ℃；脱溶剂氮气流速500 L/h；锥孔氮气流速50 L/h；高、低质量数分辨率均为15；质谱扫描范围m/z 100～400。? 　　2.3 样品处理? 　　准确称取2?DG样品25 mg，用超