体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化影响.docVIP

体外成牙环境对牙髓干细胞和外胚间充质干细胞分化影响 　　[摘要] 目的 利用牙胚细胞（TGC）作为诱导成牙环境，将牙髓干细胞（DPSC）、外胚间充质干细胞（EMSC）分别与其共培养，观察DPSC和EMSC的分化能力。方法 利用出生后4 d的大鼠TGC作为诱导成牙环境，将培养的DPSC、EMSC使用BrdU标记及鉴定后与其共培养，免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原牙本质涎蛋白（DSP）的表达和碱性磷酸酶（ALP）活性的变化，免疫组化染色鉴定及图像分析DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力。结果 共培养7 d后，EMSC共培养组DSP阳性细胞的转化率高于DPSC共培养组（P 　　共培养组ALP活性高。结论 混合培养的TGC作为诱导细胞分化的微环境与DPSC、EMSC共培养后，能够诱导细胞向成牙本质细胞分化，EMSC分化能力高于DPSC。 　　[关键词] 牙胚细胞； 牙髓干细胞； 外胚间充质干细胞； 细胞分化 　　[中图分类号] Q 254 [文献标志码] A [doi] 10.3969/j.issn.1000-1182.2012.06.005 　　成体干细胞的增殖和分化离不开特定的微环境，微环境中的间质细胞能够产生一系列生长因子或配体，与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。现有研究表明在不同的诱导条件下干细胞有向不同细胞分化的潜能，从而将其作为种子细胞参与组织的损伤与修复。牙髓干细胞（dental pulp stem cell，DPSC）、外胚间充质干细胞（ectoblast mesenchyme 　　stem cell，EMSC）都属于牙源性的间充质干细胞，它们在一定成牙诱导环境中的细胞表型及功能变化，对于组织工程化牙齿构建中种子细胞的筛选具有重要的意义。本研究利用出生后4 d的大鼠牙胚细胞（tooth 　　germ cell，TGC）作为诱导成牙环境，将DPSC、EMSC与其共培养，观察DPSC、EMSC对牙本质特异性蛋白牙本质涎蛋白（dentin sialoprotein，DSP）的表达及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性的变化，观察DPSC、EMSC在成牙环境中的分化能力，为今后组织工程化牙齿的构建提供有益的探索。 　　1 材料和方法 　　1.1 实验材料 　　K-SFM无血清培养液、表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、牛垂体提取物（bovine pituitary extract，BPE）、抗角蛋白多克隆抗体（Gibco公司，美国），25 g·L-1 Brdu（Sigma公司，美国），抗Brdu单克 　　隆抗体（武汉博士德??司），抗牙本质涎蛋白多克隆抗体（Santz Cruz公司，美国），荧光二抗：异硫氰酸荧光素（FITC）标记的山羊抗鼠IgG、罗丹明（TRITC）标记的山羊抗兔IgG（DAKO公司，美国），激光扫描共聚焦显微细胞仪（奥林巴斯公司，日本），ALP试 　　剂盒（南京建成生物工程研究所）。 　　1.2 方法 　　1.2.1 组织块酶解法培养TGC 在体视显微镜下，分离出SD仔鼠（出生4 d）下颌骨第一磨牙牙胚（组织块为1 mm3），绞碎后放入37 ℃ PBS缓冲液中，Ⅰ型胶原酶和Dispase消化，分离碎屑，离心后用无血清K-SFM培养液洗涤1次，离心并用含0.15 ng·mL-1 EGF、25 μg·mL-1 BPE的K-SFM无血清培养液将其制成细胞悬液，转入培养瓶中，37 ℃、5%CO2孵箱中培养，每日换液。用细胞角蛋白多克隆抗体染色进行鉴定。 　　1.2.2 DPSC和EMSC的BrdU标记及鉴定 将DPSC和EMSC分别接种于6孔板内，板内预先放置细胞爬片，当细胞铺满瓶底60%时，加入BrdU溶液分别孵育48 h。取出玻片，PBS冲洗，4%多聚甲醛液固定30 min，然后进行免疫组化染色鉴定。 　　1.2.3 TGC与DPSC、EMSC直接接触共培养 根据预实验结果，将标记好的DPSC、EMSC分别与牙胚细胞以1∶1的比例混合接种于6孔板内。 　　1.2.4 免疫荧光双标检测标记细胞表面抗原DSP的表达 取共培养1、3、7 d的细胞进行免疫荧光双标检测，采用共聚焦显微镜进行观察。分别以546 nm和490 nm波长的激发光观察切片TRITC和FITC所标示的抗原（TRITC阳性细胞呈红色，FITC阳性细胞呈绿色）；阴性对照采用一抗添加PBS。每张爬片随机选取8～10个不同的视野，分别计数每个视野内的细胞数及标记细胞的DSP阳性细胞数，计算各个视野阳性细胞数与细胞总数的比值，取其均值，即为细胞的转化率。 　　1.2.5 共培养细胞的免疫组化染色鉴定 对共培养的细胞同时使用LSAB组化试剂盒检测DSP表达。 　　1.2.6 图