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第十章 外源基因的表达;原核表达系统;大肠杆菌表达外源基因的优势和劣势;正确表达的基本条件;表达载体的组成;原核表达系统中通常使用的可调控的强启动子有lac（乳糖启动子）、trp（色氨酸启动子）、PL及PR（λ噬菌体左向和右向启动子）、tac（乳糖和色氨酸的杂合启动子）等。;Lac 表达系统 以大肠杆菌 lac 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。;;负调节因子 lac I 在无诱导物情形下， lacI 基因产物形成四聚体阻遏蛋白，与启动子下游的操纵基因紧密结合，阻止转录的起始。;Tac 表达系统 tac 启动子是由 trp 的 –35 序列和 lacUV5 的 –10 序列拼接而成的杂合启动子。;lac、tac 启动子对宿主菌的要求 在普通大肠杆菌中， LacI 阻遏蛋白仅能满足细胞染色体上 lac 操纵子转录调控的需要。 当多拷贝的 lacO 随着带有 lacUV5、tac 启动子的表达质粒转化进入大肠杆菌后，LacI 阻遏蛋白与 lacO 的比例显著下降，无法保证每一个 lacO 都能获得足够的 LacI 阻遏蛋白参与转录调控。 表现为在无诱导物存在的情形下， lacUV5、tac 启动子有较高的本底转录。 为了使以 Lac、Tac 表达系统具有严紧调控外源基因转录的能力，一种能产生过量的 LacI 阻遏蛋白的 lacI 基因的突变体 lacIq 被应用于表达系统。 大肠杆菌 JM109 等菌株的基因型均为 lacIq ，常被选用为 Lac、Tac表达系统的宿主菌。但是这些菌株也只能对低拷贝的表达载体实现严紧调控，在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录。 需在表达载体中插入 lacIq 基因以保证有较多的 LacI 阻遏蛋白产生。;Trp 表达系统 以大肠杆菌 trp 操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。;;T7 表达系统 大肠杆菌 T7 噬菌体具有一套专一性非常强的转录体系，利用这一体系中的元件为基础构建的表达系统称为 T7 表达系统。;化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生株，一段含有 lacI、lacUV5 启动子和T7 RNA 聚合酶基因的DNA 片段被插入其 int 基因中用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表达载体的宿主菌，调控方式为化学诱导型，类似于 Lac 表达系统。;温度诱导型 PL 启动子控制 T7 RNA 聚合酶基因，通过热诱导方式激发T7 噬菌体启动子的转录。 这种方式可以使本底转录降到很低的水平，尤其适用于表达对大肠杆菌宿主有毒性的重组蛋白质。; 双质粒系统 一个质粒带有 T7 RNA聚合酶基因，另一个质粒带有 T7 启动子和目的基因 两个质粒的复制子和抗性标记不能相同 调控方式为控制 T7 RNA 聚合酶的启动子调控类型;PL 和 PR 表达系统 以 l 噬菌体早期转录启动子 PL和PR 为核心构建的表达系统，在野生型 l 噬菌体中， PL和PR 启动子转录与否决定了 l 噬菌体进入裂解循环还是溶源循环。;转录终止子;强终止子的选择与使用 目前外源基因表达质粒中常用的终止子是来自大肠杆菌 rRNA 操纵子上的 rrnT1T2 以及 T7 噬菌体 DNA 上的 Tf。 对于一些终止作用较弱的终止子，通常可以采用二聚体终止子串联的特殊结构，以增强其转录终止作用。;翻译起始序列;核糖体结合位点 大肠杆菌核糖体结合位点包括下列四个特征结构要素： 位于翻译起始密码子上游的 6–8 个核苷酸序列 5’ UAAGGAGG 3’即Shine-Dalgarno（SD）序列，它通过识别大肠杆菌核糖体小亚基中的 16S rRNA 3’ 端区域 3’ AUUCCUCC 5’ 并与之专一性结合将mRNA 定位于核糖体上，从而启动翻译； 翻译起始密码子，大肠杆菌绝大部分基因以 AUG作为阅读框架的起始位点，有些基因也使用 GUG 或 UUG 作为翻译起始密码子。 SD 序列与翻译起始密码子之间的距离及碱基组成 基因编码区 5’ 端若干密码子的碱基序列。;SD 序列的影响 一般来说，mRNA 与核糖体的结合程度越强，翻译的起始效率就越高，而这种结合程度主要取决于 SD （ UAAGGAGG）序列与16S rRNA 的碱基互补性，其中以 GGAG 四个碱基序列尤为重要。 对多数基因而言，上述四个碱基中任何一个换成 C 或 T，均会导致翻译效率大幅度降低。 SD 序列与起始密码子之间的序列的影响 SD 序列下游的碱基若为 AAAA 或 UUUU，翻译效率最高；而CCCC 或 GGGG 的翻译效率则分别是最高值的 50% 和 25%。 紧邻 AUG 的前三个碱基成份对翻译起始也有影响。对于大肠杆菌 b-半乳糖苷酶的 mRNA 而言，在这个位置上最佳的碱基组合是 UAU 或 C