分子生物学实验2PPT.pptVIP

;实验二 PCR扩增目的基因;【实验器材】 PCR仪，台式离心机，微量移液器（20μl, 200 μl 1000 μl ）,0.2 μl Enpendorf管，电泳设备等 【实验材料】 pADH的PMD-20T质粒的模板，引物，4dNTP mix，Taq酶，PCR缓冲液、无菌水，琼脂糖，DNA染料，电泳缓冲液等。 【实验内容】 PCR基础知识介绍； PCR的基本原理； PCR引物设计原则； PCR的基本过程及程序设计； ;【实验原理】 ;【操作步骤】;3. 将加好的管充分后，离心数秒，放入PCR仪上。 4. 编辑PCR反应程序，完成后启动PCR仪。 电泳 　 PCR完成后，取5μl扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析，检查反应产物及长度。; 电泳结果如图所示;[注意] PCR非常灵敏, 操作应尽可能在无菌操作台中进行。 吸头、离心管应高压灭菌, 每次吸头用毕应更换, 不要互相污染试剂。 加试剂前, 应短促离心10秒钟, 然后再打开管盖, 以防手套污染试剂及管壁上的试剂污染吸头侧面。 应设含除模板DNA所有其它成分的负对照。 思考题 　1.降低退火温度对反应有何影响？ 　2.延长变性时间对反应有何影响？ 　3.循环次数是否越多越好？为何？ 　4.如果出现非特异性带,可能有哪些原因？ ;对PCR的优化是必需的！！！;程序设计 开机;聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR) ;PCR;PCR扩增;PCR特点及应用;PCR应用;PCR反应中的成份;位核苷酸对应,以减少因密码子摆动产生的不配对。 (5) 在引物内, 尤其在3‘端应不存在二级结构。 (6) 两引物之间尤其在3‘端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 (7) 引物5‘端可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、地高辛等。通常应在5’端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。 (8) 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。;2. 四种三磷酸脱氧核苷酸(4XdNTP) dNTP应用NaOH将pH调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装,-20℃贮存。 一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4种dNTP各20μmol/L，足以在100μl???应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制TaqDNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入。 ; 3. Mg2+： Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性，影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团， 例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+ 浓度。;Determine your Mg2+ Concentration;4. 模板： PCR反应必须以DNA为模板进行扩增, 模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状也可以是环状分子。模板影响PCR的主要因素是数量和纯度。一般对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA。扩增多拷贝序列时，用量更少。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率。 5. Taq DNA聚合酶： 一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min，95℃ 40min，97℃5min。现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶，这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间。;灭活Taq DNA聚合酶的方法有： (1) PCR产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。 (2) 加入10mmol/L的EDTA螯合Mg2+。 (3) 99-100℃加热10min. (4)目前已有直接纯化PCR产物的Kit可用。;6. 反应缓冲液： 反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris·Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。Tris·Cl在20℃时pH为8.3-8.8,但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8。50mmol/L的KCl有利于引物的